2021高三生物人教版一轮学案：第36讲　基因工程 Word版含解析

2021高三生物人教版一轮学案：第36讲　基因工程 Word版含解析

www.ks5u.com 第十一单元 　现代生物科技专题 第36讲　基因工程 最新考纲 高频考点 核心素养 ‎1.基因工程的诞生(Ⅰ)‎ ‎2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)‎ ‎3．基因工程的应用(Ⅱ)‎ ‎4．蛋白质工程(Ⅰ)‎ ‎5．DNA的粗提取与鉴定 ‎1.基因工程的工具与操作程序及应用 ‎2．蛋白质工程的操作 ‎1.生命观念——结构决定功能：基因的结构与功能 ‎2．科学思维——建立模型：基因工程的操作流程 ‎3．科学探究——解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程 考点1　基因工程的操作工具 ‎1．基因工程的概念理解 ‎(1)供体：提供目的基因。‎ ‎(2)操作环境：无菌。‎ ‎(3)操作水平：DNA分子水平。‎ ‎(4)原理：基因重组。‎ ‎(5)受体：表达目的基因。‎ ‎(6)本质：性状在受体生物体内表达。‎ ‎(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。‎ ‎2．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)‎ ‎(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。‎ ‎(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。‎ ‎(3)结果：产生黏性末端或平末端。‎ ‎3．DNA连接酶 ‎(1)功能：缝合被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。‎ ‎(2)类型 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只“缝合”黏性末端 ‎“缝合”黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ‎4.载体 ‎(1)常用载体——质粒 ‎(2)其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。‎ ‎(3)载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。‎ 判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)‎ ‎1．切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　×　)‎ ‎2．载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(　√　)‎ ‎3．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(　×　)‎ ‎4．限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(　×　)‎ ‎5．E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(　×　)‎ ‎6．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　×　)‎ ‎7．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(　×　)‎ ‎8．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(　×　)‎ ‎9．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(　√　)‎ ‎10．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(　×　)‎ ‎11．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(　×　)‎ ‎1．(选修3P6“寻根问底”改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。‎ 提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。‎ ‎2．(选修3P6“旁栏思考题”)想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？‎ 提示：能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等。‎ ‎ 限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓‎ AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。‎ 提示：适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。‎ ‎●考向突破1　限制性核酸内切酶、DNA连接酶等酶的作用 ‎1．(2020·江苏苏锡常镇四市高三调研)科学家尝试使用Cre/loxP位点特异性重组系统，在检测目的基因导入成功后，删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因。其技术过程如下(图中的■代表基因前的启动子)，据图回答下列问题：‎ ‎(1)loxP是一种只有34个碱基对构成的小型DNA片段，由两个13个碱基对反向重复序列和中间间隔的8个碱基对序列共同组成，自身不会表达，插入质粒后也不影响原有基因的表达，其碱基序列如下：‎ ‎　　　　　　　　　‎ Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的限制酶。‎ ‎(2)将重组质粒导入植物细胞中最常用的方法是农杆菌转化法。作为标记基因，抗除草剂基因用于检测目的基因是否导入成功的原理是抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，可以通过检测抗除草剂基因是否存在，从而判断目的基因是否导入成功。‎ ‎(3)经检测成功后，抗除草剂基因已没有用途，继续留在植物体内可能会造成的安全问题是抗除草剂基因可能转移到杂草中。经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开后，可得到如上图右侧的这两个DNA分子。由于除草剂基因前没有了启动子的原因，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。‎ ‎(4)loxP序列是有方向性的。如果经Cre酶处理后，发现抗除草剂基因反向连接在质粒一上，则原来质粒一中这两个loxP序列的方向是C。‎ A．两个都是正向 B．两个都是反向 C．一个正向一个反向 D．与方向无关 解析：(1)根据题意，Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的限制酶。(2)由 ‎于抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，因此作为标记基因，可用于检测目的基因是否成功导入受体细胞。(3)抗除草剂基因留在植物体内可能转移到杂草中造成基因污染。经Cre酶处理后，抗除草剂基因前没有了启动子，抗除草剂基因在受体细胞内不再表达。(4)loxP序列是有方向性的。根据图示Cre酶处理后的结果，可知原来质粒一中这两个loxP序列一个正向一个反向，选C。‎ 整合提升 归纳与DNA相关的六种酶 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段 DNA连 接酶 磷酸二 酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合 酶或热稳定 DNA聚合酶 磷酸二 酯键 脱氧 核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端 DNA ‎(水解)酶 磷酸二 酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之 间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA 聚合酶 磷酸二 酯键 核糖 核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端 ‎●考向突破2　载体的作用和特点分析 ‎2．(2020·福建龙岩一中实验班月考)如图所示为pBR322质粒，其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因，ori为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点，并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载体。回答下列相关问题： ‎ ‎(1)制备重组质粒，需要限制酶和DNA连接酶。如制备重组质粒时，使用Pvu Ⅰ切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加四环素。‎ ‎(2)该质粒中的BamHⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为，而Sau‎3A Ⅰ识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamH Ⅰ和Sau‎3A Ⅰ分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链，则Sau‎3A Ⅰ识别的核苷酸序列及切割位点为。该拼接在一起的DNA片段，不一定(填“能”“否”或“不一定”)被BamH Ⅰ识别。‎ ‎(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒中还应有启动子、终止子和目的基因等三种特殊的DNA片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别为显微注射法，农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(后者答出一个即可)，如受体细胞为大肠杆菌，则该菌经钙离子处理后，具备将外界DNA吸入细胞的特性。‎ 解析：(1)基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶。使用Pvu Ⅰ切割pBR322质粒会破坏ampr(氨苄青霉素抗性基因)而tetr(四环素抗性基因)不受破坏所以可用含有四环素的培养基来筛选具有目的基因的细胞。‎ ‎(2)综合题目信息，可推知Sau‎3A Ⅰ识别的核苷酸序列及其切割位点为，这样Sau‎3A Ⅰ和BamH Ⅰ切割DNA时才能形成相同的黏性末端，进而能拼接成一条DNA链。重新拼接点的核苷酸序列不一定是—GGATCC—，因此不一定能被BamH Ⅰ识别，但一定能被Sau‎3A Ⅰ识别。‎ ‎(3)一个完整的重组质粒有标记基因、目的基因、启动子、终止子和复制原点等特殊片段。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，而导入动物细胞的方法有显微注射法。钙离子处理后的大肠杆菌，将处于感受态，该状态的细胞具有将外界DNA吸入细胞的特性。‎ 考点2　基因工程的基本操作 ‎1．目的基因的获取 ‎(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。‎ ‎(2)方法 ‎2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 ‎(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。‎ ‎(2)基因表达载体的组成 ‎(3)构建过程 ‎3．将目的基因导入受体细胞 ‎4.目的基因的检测与鉴定 判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)‎ ‎1．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　√　)‎ ‎2．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。(　√　)‎ ‎3．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。(　×　)‎ ‎ 如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：‎ ‎(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？‎ ‎(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？‎ ‎(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？‎ 提示：(1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。‎ ‎(2)采用的方法是农杆菌转化法。由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。‎ ‎(3)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。‎ ‎●考向突破　基因工程的基本操作 ‎1．(2020·广东高三模拟)烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：‎ ‎(1)过程①所用RNA可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中获取。‎ ‎(2)过程②可以采用PCR(或多聚酶链式反应)技术获得大量目的基因，该技术的实质是双链DNA复制。‎ ‎(3)过程④最常用的方法是农杆菌转化法，该方法中需将目的基因插入受体细胞的染色体DNA上。‎ ‎(4)过程⑤所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加入的特殊物质是植物激素(或生长素和细胞分裂素)。过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是抗原—抗体杂交法。‎ 解析：(1)根据题图分析可知，①表示逆转录过程，其模板RNA逆转录形成的DNA中含有目的基因(抗TMV基因)，因此该RNA可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中提取。‎ ‎(2)过程②表示获取目的基因的过程，利用PCR技术可以大量扩增目的基因，PCR技术的原理是双链DNA的复制。‎ ‎(3)过程④表示将目的基因导入受体细胞的过程，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，该方法可将目的基因插入到受体细胞的染色体DNA上。‎ ‎(4)过程⑤表示植物组织培养过程，此过程需要在培养基中加入植物激素，如细胞分裂素和生长素；过程⑥表示目的基因的检测与鉴定过程，对于产生的蛋白质可以采用抗原—抗体杂交法进行检验。‎ ‎2．(2020·湖北七市一模)基因工程是从分子水平对基因进行操作，从而实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题：‎ ‎(1)构建基因组文库的一般步骤：‎ ‎①提取某种生物体内的全部DNA或全部基因，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；‎ ‎②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；‎ ‎③将重组载体导入受体菌的群体中储存，基因组文库构建完成。‎ ‎(2)与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。其原因是cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因。‎ ‎(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理。其目的是获得与DNA片段相同的黏性末端。‎ ‎(4)受体菌被导入重组DNA分子之前，常用Ca2＋处理，提高导入的成功率。‎ 解析：(1)构建基因组文库的一般步骤为①提取某种生物体内的全部DNA或全部基因，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；③重组载体导入受体菌的群体中储存，基因组文库构建完成。‎ ‎(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因，因此与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。‎ ‎(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理，以获得与DNA片段相同的黏性末端。‎ ‎(4)将重组DNA导入受体菌群之前，常用钙离子处理，以提高导入的成功率。‎ 整合提升 选择限制酶的方法 ‎(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ‎①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。‎ ‎②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。‎ ‎③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。‎ ‎(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ‎①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。‎ ‎②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。‎ 考点3　基因工程的应用与蛋白质工程 ‎1．动物基因工程与植物基因工程的应用 ‎(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高畜产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。‎ ‎(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。‎ ‎2．基因诊断与基因治疗 ‎(1)基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。‎ ‎(2)基因治疗 ‎①概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。‎ ‎②成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗复合型免疫缺陷症。‎ ‎③‎ ‎3．蛋白质工程 ‎(1)概念 ‎(2)基本流程 写出流程图中字母代表的含义：‎ A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，‎ E．预期功能。‎ ‎(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。‎ ‎(4)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。‎ 判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)‎ ‎1．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(　×　)‎ ‎2．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(　×　)‎ ‎3．由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(　×　)‎ ‎4．蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(　√　)‎ ‎●考向突破1　基因工程的应用分析 ‎1．(2020·湖南株洲教学质检)鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：‎ ‎(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列。科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是：Ti质粒内，每种限制酶有1个切割位点，酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同(填“相同”或“不相同”)。‎ ‎(2)步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点，步骤③中需先用Ca2＋处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。‎ ‎(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录或鸡干扰素的mRNA已经被水解。‎ 解析：(1)利用PCR技术扩增鸡干扰素基因时，引物应可以和鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列进行碱基互补配对，根据鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列可设计引物的碱基序列。据图可知，该转基因过程用EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶分别切割目的基因和质粒，以避免质粒或目的基因的自身连接，应在两种引物的一端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列GAATTC和GGATCC，以便于后续的剪切和连接。Ti质粒中每种限制酶有1个切割位点，则酶切产物两端黏性末端不同，不会发生自身环化。‎ ‎(2)基因表达载体中除含有启动子、终止子、标记基因和目的基因外，还应含有复制原点，以便在宿主细胞中复制。将基因表达载体导入农杆菌前，可用Ca2＋处理农杆菌，以增大细胞壁通透性，提高转化效率。‎ ‎(3)提取愈伤组织细胞的RNA后，可通过逆转录获得DNA。鸡干扰素基因即便导入了农杆菌，也不一定能导入烟草愈伤组织细胞，导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因不一定能够正常转录，转录出鸡干扰素的mRNA 若被水解，则不能通过逆转录获得鸡干扰素基因，以上原因均可能导致烟草愈伤组织细胞中不能检测出鸡干扰素基因。‎ ‎2．(2020·河南中原名校高三质检)干旱会影响农作物产量，科学家们对此进行了研究。下图为用基因探针检验某一抗旱植物基因型的原理，相关基因用R和r表示，回答下列问题：‎ ‎(1)在利用PCR技术扩增R或r基因的过程中，利用引物可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。‎ ‎(2)若被检植株发生A现象，不发生B、C现象。据此推测检测另一抗旱植物时会发生A或B(填“A”“B”或“A或B”)现象。‎ ‎(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶，限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。‎ ‎(4)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。‎ ‎(5)要快速繁殖转基因抗旱烟草植株，目前常用的技术是植物组织培养技术，该技术的基本过程是：将离体的烟草细胞诱导脱分化形成愈伤组织 ‎，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是：突变体的利用和单倍体育种。‎ 解析：(1)用PCR技术扩增R或r基因时，需要用引物寻找抗旱基因的位置。‎ ‎(2)被检植物发生A现象，不发生B、C现象，即r探针没有形成杂交环，所以被检植物的基因型应为RR。因此另一抗旱植物的基因型应为RR或Rr，据图分析可发生A或B现象。‎ ‎(3)限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。‎ ‎(4)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。‎ ‎(5)植物组织培养技术可快速繁殖抗旱烟草植株，该技术包括脱分化和再分化两个基本过程，其中先将离体的烟草细胞诱导脱分化形成愈伤组织，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是：突变体的利用和单倍体育种。‎ ‎●考向突破2　蛋白质工程的概念和过程的辨析 ‎3．(2020·安徽马鞍山二中模拟)胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，并要经过较长的时间才能进入血液中，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：‎ ‎(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是蛋白质的预期功能。‎ ‎(2)人工合成的DNA与载体结合后，被转移到大肠杆菌等受体细胞中才能得到准确表达。‎ ‎(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有蛋白质工程、基因工程和发酵工程。‎ ‎(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？‎ 根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因。‎ 解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素，即速效胰岛素的功能。‎ ‎(2)人工合成的目的基因与载体结合后，被导入受体细胞中才能得以表达。‎ ‎(3)利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，得到目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌，再利用工程菌进行发酵，从而获取大量产品，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。‎ ‎(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序列，然后用DNA合成仪直接合成出新的基因。‎ 考点4　PCR技术和DNA粗提取与鉴定 ‎1．PCR技术 ‎(1)原理：DNA双链复制 ‎(2)条件 ‎(3)过程 过程 说明 图解 变性 当温度上升到‎90℃‎以上时，双链DNA解聚为单链 ‎(续表)‎ 过程 说明 图解 复性 温度下降到‎50 ℃‎左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 ‎72℃‎左右时，Taq DNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸 ‎(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。‎ ‎2．DNA的粗提取与鉴定 ‎(1)实验原理 ‎①DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 项目 溶解规律 ‎2 mol/L NaCl 溶液 ‎0.14 mol/L NaCl 溶液 DNA 溶解 析出 蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大 部分发生 盐析沉淀 溶解 ‎②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。‎ ‎③DNA与二苯胺沸水浴加热，呈蓝色。‎ ‎(2)操作流程 材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织 ‎↓‎ 破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞→加蒸馏水→用玻璃棒搅拌→用纱布过滤→收集滤液 ‎↓‎ 去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质 ‎↓‎ DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液 ‎↓‎ DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管置于沸水中加热5 min，溶液变成蓝色 判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)‎ ‎1．进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨。(　×　)‎ ‎2．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度。(　×　)‎ ‎3．将制备的含有DNA的滤液加入60～‎‎75 ℃‎ 的恒温水浴箱中保温10～15 min，可以将DNA析出。(　×　)‎ ‎ 下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析回答下列问题：‎ ‎(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？‎ ‎(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？‎ ‎(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 mol/L NaCl的目的是什么？‎ 提示：(1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。‎ ‎(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除溶于酒精的杂质。这时候搅拌要沿一个方向，轻缓地进行。‎ ‎(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。‎ ‎●考向突破1　PCR技术 ‎1．PCR是多聚酶链式反应的缩写，利用PCR技术可对目的基因进行扩增。请根据下面PCR反应原理示意图回答有关问题：‎ ‎(1)PCR的原理是DNA双链复制。‎ ‎(2)PCR技术中DNA解链是通过高温加热实现的，DNA的这种解链现象在一定条件下是可逆的(填“可逆的”或“不可逆的”)。‎ ‎(3)DNA解链后冷却的目的是让引物与互补DNA链相结合。‎ ‎(4)当温度加热至70～‎75 ℃‎时，是热稳定DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物上。如此逐渐延伸形成互补链，进而使目的基因加倍。‎ ‎(5)通过重复循环(2)、(3)、(4)过程，使目的基因以指数形式扩增。‎ 解析：(1)PCR的原理是DNA双链复制。‎ ‎(2)PCR技术通过高温加热使DNA解链，DNA的这种解链现象在一定的条件下是可逆的，即降低温度后能复性。‎ ‎(3)DNA解链后冷却的目的是让引物与互补DNA链相结合，形成局部双链。‎ ‎(4)当温度加热至70～‎75 ℃‎时，是热稳定DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物上。‎ ‎(5)PCR技术中，目的基因以指数形式扩增。‎ 归纳提升 ‎(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。‎ ‎(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。‎ ‎(3)原理：DNA双链复制。‎ ‎(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。‎ ‎(5)过程 第一步：加热至90～95 ℃，DNA解链为单链；‎ 第二步：冷却至55～60 ℃，引物结合到互补DNA链；‎ 第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)‎ 从引物起始进行互补链的合成。‎ 如此重复循环多次。‎ ‎●考向突破2　DNA的粗提取与鉴定 ‎2．实验中对DNA进行鉴定时，有如下操作：‎ ‎(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。‎ ‎(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？溶液颜色基本不变。‎ ‎(3)在沸水浴中加热的目的是加快颜色反应速度，同时说明DNA对高温有较强的耐受性。‎ ‎(4)A试管在实验中的作用是对照。‎ ‎(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA(丝状物)的多少有关。‎ 解析：A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。‎ 整合提升 DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、‎‎4”‎ 加蒸馏 水2次 ‎①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出 用纱布 过滤4次 ‎①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液 用NaCl 溶液4次 ‎①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA ‎1．‎ 限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。‎ ‎2．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。‎ ‎3．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。‎ ‎4．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵，培育转基因植物时的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。‎ ‎5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。‎ ‎6．目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。‎ ‎ ‎ 限制酶是一类酶，而不是一种酶。‎ ‎ ‎ 将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。‎ ‎ ‎ 不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。‎ ‎ ‎ 限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。‎ ‎ ‎ 基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜上载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。‎ ‎ ‎ 基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。‎ ‎ ‎ ‎①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)；②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。‎ ‎ ‎ 目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间。‎ ‎ ‎ 受体细胞选择时需注意：要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。‎ ‎1．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。‎ ‎(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。‎ ‎(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90～95_℃。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。‎ ‎(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。‎ 解析：(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。‎ ‎(2)体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90～‎95 ℃‎，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。‎ ‎(3)由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。‎ ‎2．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：‎ ‎(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。‎ ‎(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。‎ ‎(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。‎ 解析：‎ 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞，且重组质粒在不同细胞中能正常表达，说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同，生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中，受体细胞为大肠杆菌细胞时，常用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于感受态，即Ca2＋参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌，故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏，可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。‎ ‎3．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下。图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。‎ ‎(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。‎ ‎(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。‎ ‎(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。‎ 解析：‎ ‎(1)构建基因表达载体时，使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的两种限制酶，可以防止自身环化，并且保证融合基因和质粒正确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光，说明L1基因已经表达，即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因，需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板，用PCR方法进行鉴定。‎ ‎4．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：‎ ‎(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。‎ ‎(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快，容易培养(答出两点即可)等优点。‎ ‎(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导。如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。‎ 解析：‎ 本题主要考查了基因工程的相关知识。(1)人体基因A有内含子，将获得的基因A导入大肠杆菌中，经过转录得到含有内含子对应序列的mRNA，因为大肠杆菌没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。内含子部分对应的mRNA序列阻断了蛋白A的合成。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，选用昆虫病毒作为载体，不选用噬菌体作载体的原因是噬菌体的宿主细胞是细菌，噬菌体不能侵染家蚕。‎ ‎(3)大肠杆菌是原核生物，原核生物作为受体细胞，有以下优点：结构简单、繁殖速度快、容易培养等。‎ ‎(4)要检测基因A是否翻译出蛋白A，最准确的方法是利用蛋白A的抗体，因抗体具有特异性，一种抗体只能与特定的蛋白质结合，可根据蛋白A抗体的杂交情况来判断是否合成了蛋白A。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中将一种生物个体的DNA转移到了另一种生物个体中，并表达合成了相应的蛋白质。‎ ‎5．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：‎ ‎(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。‎ 提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。‎ ‎(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。‎ ‎(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子(答出两点即可)。‎ ‎(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。‎ ‎(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是 目的基因的转录或翻译异常。‎ 解析：(1)嫩叶相对于老叶，细胞壁较薄，较易破碎，容易提取几丁质酶的mRNA；由于RNA酶可降解RNA，提取RNA时，提取液中应添加RNA酶抑制剂，以防止所提取的RNA降解。‎ ‎(2)以mRNA为模板、4种脱氧核苷酸为原料，在逆转录酶的作用下，按照碱基互补配对原则，mRNA可通过逆转录合成cDNA。‎ ‎(3)目的基因中缺乏表达所需要的复制原点、启动子等，而质粒载体中含有，为了使目的基因在受体细胞中表达，应将目的基因与质粒载体形成重组质粒，导入受体细胞。‎ ‎(4)DNA连接酶可将同种限制酶切割产生的末端连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。‎ ‎(5)几丁质酶基因整合到植物基因组中，但植物抗真菌病的能力没有提高，说明几丁质酶基因在植物细胞中未表达。依据中心法则可知，基因表达包括转录和翻译两个过程，可能是目的基因的转录或翻译过程异常导致目的基因在受体细胞中未表达，进而导致植物抗真菌病的能力没有提高。‎