生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中三种酶活性的影响

生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中三种酶活性的影响

　　生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中三种酶活性的影响：康照昌李玉荣敖明章【摘要】目的通过建立运动病模型，检测生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中碱性磷酸酶(AOP)、Na+K+ATP酶和细胞色素氧化酶(CCO)活性的变化，并探讨其治疗运动病的机制。方法雄性SD大鼠40只，随机分5组，每组8只，每天按实验方法刺激，同时实验组给予生姜透皮贴治疗。实验第3天刺激结束后迅速断头处死，冰上迅速分离脑组织，取大脑皮质和小脑皮质、脑干前庭区。采用组织化学定位方法和图像定量分析方法，检测各组大鼠上述三部位脑组织中ALP、Na+K+ATP酶及CCO活性。结果运动病大鼠三部位脑组织中ALP活性显著升高、Na+K+ATP酶及CCO活性明显降低。与模型组相比，使用生姜透皮贴后运动病大鼠三部位脑组织中ALP活性显著减低、Na+K+ATP酶及CCO活性明显升高。结论生姜透皮贴可能通过降低脑血管紧张度，改善脑血流的分布，增加脑血流量，调整脑细胞内CCO、ALP、Na+K+ATP酶等酶的活性，增强脑细胞的兴奋性，从而保持中枢神经系统的兴奋性，起到抗运动病的作用。【关键词】生姜透皮贴;运动病;碱性磷酸酶;Na+K+ATP酶;细胞色素氧化酶\n　随着现代航天航海事业的发展，世界各国都在开展运动病的研究工作，对防治运动病的研究已经取得了一定的成果，但尚无公认的疗效确切、副作用少的治疗措施。寻找更为有效、更安全的抗运动病方法日益引起国内外重视。目前的抗运动病药物主要包括抗胆碱、抗组胺类及拟交感胺类等，虽有一定的抗运动病作用，但多有中枢抑制作用，限制了其临床使用。而我国自古就应用中草药生姜抗眩晕病，生姜有确切的抗运动病防止晕车、晕船的作用〔1〕。美国科学家也证明生姜确有防晕船等效果〔2〕，且相对其他防晕船药物相比，无口干，昏睡，血压降低等副作用。近年来，国内学者进行的动物实验证实，生姜的有效成分有明显的止吐抗运动病的作用〔3〕，且无明显副作用。南通医学院航海医学研究所与南通市中医院联合研究的生姜合剂由生姜、半夏等6味中药组成〔4〕，及单独的生姜粉等用于防治运动病，效果较晕海宁强，副作用不明显，因而生姜成为各国学者普遍看好的新的抗运动病药物。本实验运用乙醇法提取生姜有效成分，将其与透皮剂氮酮混合制成帖剂贴在运动病大鼠的脐部〔5〕，测定大鼠大脑皮质、小脑皮质、脑干前庭区脑细胞中Na+K+\nATP酶、碱性磷酸酶(ALP)、细胞色素氧化酶(CCO)活性变化〔6〕，透皮疗法使药效发挥更加持久，而且方法简便，作用迅速〔7〕，为抗运动病新型药物的研究提供新的思路。　　1材料与方法　　1.1动物及分组雄性SD大鼠40只、体重(200±10)g，购自湖北省实验动物中心，动物合格证号：SYXK(鄂)20030007，检疫后备用。单笼饲养，自由摄食水，饲养1in。随后给予2h的运动病刺激：将大鼠无束缚地放入旋转装置中的有机玻璃笼内，先顺时针方向加速度从16°/S2加速至120°/S2，然后立即以45°/S2减速至0，马上逆时针再以16°/S2加速至120°/S2，然后以45°/S2减速至0，如此反复。旋转时间为2h〔8〕，除正常组不接受旋转刺激外，其他各组处理相同，旋转刺激完成后动物放回饲养笼中。连续刺激3d，1次/d。每天观察动物接受刺激后的反应情况，第3天刺激结束后取动物迅速断头处死，冰上迅速分离脑组织，取出大鼠三部位脑组织，放入液氮，转入-80℃冰箱备用。　　1.2药品与材料生姜透皮贴：生姜(华中科技大学鉴定)清洗去杂切碎，双蒸水浸泡，闪式提取器提取，过滤，滤液减压浓缩至浸膏状，按50、100和200mg/kg将生姜浸膏与氮酮混匀，制成3cm×4cm生姜透皮贴，另用氮酮制作空白贴剂供模型组使用。ALP试剂盒(批号：060101)、Na+K+ATP酶试剂盒(批号：060101)、CCO试剂盒(批号：060101)均购自南京建成生物工程研究所。\n　　1.3实验仪器低温高速离心机(Backman)、电热恒温水温箱(上海医疗器械七厂)、721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。　　1.4酶细胞化学反应将组织用含2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸钠缓冲液固定液(pH1.4　0.1mol/L)4℃固定1h。二甲砷酸钠缓冲液漂洗后，与液氮冷冻后两组样品并列放在一起,恒冷箱冷冻切片为10μm，分别测定进行Na+K+ATP酶、ALP和CCO〔9〕。用1%锇酸固定1h，EPON812包埋，LKB超薄片机切片，不进行电子染色，直接在HITACHIH300型电镜下观察。　　1.5酶活性定量分析采用XY540型彩色图像分析系统定量分析〔10〕，128×128像素点，每张切片随机测5次，酶切片反应至少测30次，以阳性反应面积(单位为μm2)作为酶反应强度的参数，取其平均值。　　1.6统计学处理实验数据以x±s表示，应用SPSS12.0统计软件进行方差分析。　　2.3各组大鼠脑干前庭区三种酶活性运动病大鼠脑干前庭区中Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠脑干前庭区中ALP、Na+K+ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小，见表2。表2\n大鼠脑干前庭区三种酶活性的图像定量分析(x±s，n=8)　　2.4各组大鼠小脑皮质三种酶活性运动病大鼠小脑皮质中Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠小脑皮质区中ALP、Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小，见表3。表3大鼠小脑皮质三种酶活性的图像定量分析(x±s，n=8)　　3讨论　　大脑和小脑皮质及脑干前庭区等中枢对运动病的发病有关〔11〕。ALP和Na+K+ATP酶反应产物主要定位于以上三部位毛细血管内皮细胞膜上，也呈阳性反应。CCO反应产物主要定位于以上三部位脑细胞线粒体膜上。　　旋转刺激可引起神经细胞膜Na+K+ATP酶活性下降，ALP活性上升，线粒体CCO活性下降。这可能表明旋转刺激引起Na+K+泵效率明显下降，导致细胞膜外K+浓度上升，高浓度K+可打开神经细胞膜上电压依赖性Ca2+通道，导致Ca2+内流。神经细胞膜外高K+和细胞内高Na+浓度梯度是引起Ca2+内流和神经细胞兴奋性降低的一个重要因素，ALP活性上升可能与膜的通透性增加有关，同Ca2+内流亦相关。CCO活性降低同有氧代谢水平降低有关，这可能是脑血流量减少的一个重要因素〔12〕。\n　　何丽娅〔13～15〕等在家兔急性完全脑缺血再灌注模型上观察生姜的脑复苏效应，显示生姜提取液能抑制脑组织脂质过氧化产物MDA的生成，提高脑组织中SOD活性和Na+K+ATP酶活性，能有效地保护缺血再灌注大脑的过氧化氢酶活性，同时改善缺血组织代谢和缺氧状况，明显改善细胞膜上Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶活性。　　本实验应用组织化学定位方法和图像定量分析方法，研究表明，旋转刺激可引起大脑和小脑皮质及脑干前庭区神经细胞Na+K+ATP酶活性下降，ALP活性上升,线粒体CCO活性下降。用生姜透皮贴后，运动病大鼠三种脑组织ALP活性显著减低、Na+K+ATP酶及CCO活性明显升高。　　综上所述，生姜提取物制成透皮贴可能通过改善脑血流分布，调整细胞内CCO、ALP、Na+K+AT酶和ALP等一系列酶活性，增强脑细胞的兴奋性，从而保持中枢神经系统兴奋性，起到抗运动病的作用。　　尽管近年来对运动病发病机制有了较多较深入的认识，但要清晰地阐明运动病发生的神经通路仍有待深入的研究。随着航空航天事业的发展，运动病的预防和治疗已成为神经科学\n、军事医学及临床医学的重要研究课题之一〔16〕。目前对于生姜的有效成分的提取，化学成分分析，药理作用研究和临床应用等方面，均取得了较大进展。本实验使用生姜提取物制成的透皮贴，它具有吸收快、药效持久释放、作用效果好且无副作用等特点，为运动病的防治提供了很好的思路，为研制新型抗运动病药物提供实验依据，下一阶段将使用生姜透皮贴运用于预防和治疗运动病人的实验研究，将为运动病人带来福音。【参考文献】　1徐根兴，金淑仪，董文度，等.脑益嗪抗运动病时大鼠脑细胞钙离子超微结构定位的变化〔J〕.中华航海医学杂志，1998;5(3)：12930.　　2ZhangTY，SuenCY.Afastparallelalgorithmforthinningdigitalpatterns〔J〕.mACM，1984;27(3)：2368.　　3黄明方，侯建萍，盖晓波，等.生姜抗运动病研究进展〔J〕.中华航海医学与高气压医学杂志，2006;6(3):1924.　　4姜正林,徐兵,杨凯，等.生姜合剂对运动病大鼠血液肾素、血管紧张素、醛固酮水平的影响〔J〕.中华航海医学与高气压医学杂志，2001;8(1)：156.　　5\n许守芳.中药敷脐治疗甲氨蝶呤化疗致腹泻效果观察〔J〕.护理学杂志，2004;19(5)：356.　　6孔晓妮，郭俊生,李敏，等.模拟运动病大鼠海马组织中一氧化氮、超氧化物歧化酶、丙二醛含量的变化〔J〕.中华航海医学与高气压医学杂志，2003;10(4)：193.　　7秦云峰，张小平.中医外治疗法集萃〔M〕.呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，2002：101.　　8姜正林，沈洪妹,杨凯，等.大鼠运动病模型条件性厌食症的建立〔J〕.中国航海医学杂志，2000;7(2):97100.　　9徐根兴.定量细胞学与细胞化学技术〔M〕.长春:吉林科学技术出版社,1993：12830.　　10宁可.神经元钙通道与cfos原癌基因表达的关系及其在颅脑创伤中的意义〔J〕.国外医学·创伤与外科基本问题分册，1995;16(3):14951.　　11\n雷呈祥，王国华，储智勇，等.速效抗晕胶囊抗运动病作用的实验研究〔J〕.解放军药学报，2009;25(1)：568.　　12王琰，徐根兴，董文度,等.模拟运动病Ca2+内流机制探讨〔J〕.中国航海医学杂志，2002;12(4)：197200.　　13何丽娅，吴和平，黄崇新,等.生姜对脑缺血再灌注损伤防治作用的探讨〔J〕.现代应用药学，1995;12(5)：356.　　14何丽娅，吴和平，刘金雄,等.生姜对家兔实验性脑缺血再灌注损伤的复苏疗效研究〔J〕.实用中西医结合杂志，1996;9(3)：1557.　　15何丽娅，黄崇新，李松平,等.生姜对缺血性脑损伤时过氧化氢酶、Ca2+ATP酶活性及乳酸含量的影响〔J〕.医学理论与实践,1999;12(1):7982.　　16ShermanCR.Motionsickness：revieed，2002;9(5):2516.