【生物】2018届一轮复习苏教版无菌操作技术教案

【生物】2018届一轮复习苏教版无菌操作技术教案

选修1　生物技术实践 第1讲　无菌操作技术 考点一| 微生物的分离和培养 ‎1．相关技能、技术和方法 ‎(1)无菌操作的技能——灭菌 ‎①分类：实验室常用高温处理达到灭菌效果，包括干热灭菌和湿热灭菌。‎ ‎②作用：微生物分离和培养的基础。‎ ‎③关键：防止外来杂菌的入侵。‎ ‎(2)配制培养基 ‎①培养基概念：‎ 为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养物质。‎ ‎②分类：按化学性质的不同分为天然培养基和合成培养基。‎ ‎(3)接种微生物 ‎①接种：指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。‎ ‎②接种方法和常用工具(连线)‎ 接种方法　　　　常用工具 Ⅰ.涂布平板接种　　 a．接种针 Ⅱ.穿刺接种　 b．接种环 Ⅲ.斜面接种 c．玻璃涂布器 Ⅳ.平板划线接种 ‎【答案】　Ⅰ－c　Ⅱ－a　Ⅲ－b　Ⅳ－b ‎2．大肠杆菌的接种与分离培养 ‎(1)配制牛肉膏蛋白胨培养基 其操作步骤：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。‎ ‎(2)斜面接种和培养大肠杆菌 ‎①主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。‎ ‎②主要步骤：准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37_℃恒温箱中培养大肠杆菌24 h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(‎4 ℃‎)保存。‎ ‎(3)平板划线分离和培养大肠杆菌 ‎①平板的作用：培养、分离细菌等微生物。‎ ‎②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。‎ ‎1．培养基 ‎(1)培养基的成分 营养物质 含义 作用 主要来源 碳源 能提供碳元素的物质 构成生物体的物质，异养生物的能源物质 无机物：CO2、NaHCO3；有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等 氮源 能提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物 无机物：N2、NH3、氨盐、硝酸盐；‎ 有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 生长因子 生长必不可少的微量有机物 酶和核酸的成分 维生素、氨基酸、碱基等 水 细胞生命活动必不可少的物质 不仅是良好的溶剂，还是结构物质 培养基、大气、代谢产物 无机盐 提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养型细菌的能源；酶的激活剂 培养基、大气 ‎(2)培养基的分类 种类 特点 应用 物理性质 液体培养基 不加凝固剂 工业生产 固体培养基 加凝固剂 微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏 化学成分 天然培养基 含化学成分不明的天然物质 工业生产 合成培养基 培养基成分明确或用一定化学物质配制 分类、鉴定 用途 选择培养基 添加某物质，抑制杂菌生长，促进所需微生物生长 培养分离出特定微生物 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂 鉴别微生物 ‎2.无菌技术 视角　 微生物的分离和培养 ‎1．(2017·江西赣中南五校第一次联考)‎ 下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。‎ 成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4‎ 指示剂 琼脂 含量(g)‎ ‎10.0‎ ‎5.0‎ ‎5.0‎ ‎2.0‎ ‎0.2‎ ‎12.0‎ 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL ‎(1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于__________。‎ ‎(2)若根据用途划分，该培养基属于__________(填“选择”或“鉴别”)培养基。若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？__________，并用__________作为指示剂。‎ ‎(3)在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行__________；操作者的双手需要进行清洗和__________。‎ ‎(4)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：______________和______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的__________。‎ 图1　　　　　　　　图2‎ ‎【解析】　(1)大肠杆菌只能从环境中摄取有机物，不能自己合成有机物，属于分解者。(2)该培养基中含有指示剂，属于鉴别培养基。尿素分解菌可以分解尿素，而其他微生物不能，因此可将培养基中的蛋白胨改为尿素用于筛选土壤中的尿素分解菌，并用酚红作为指示剂，尿素分解菌分解尿素产生了NH3可使酚红变红。(3)培养微生物时，培养基和培养皿需要灭菌，操作者双手需要进行消毒。(4)图1采用的是稀释涂布平板法，图2采用的是平板划线法。单个微生物细胞繁殖所形成的细胞群叫菌落。‎ ‎【答案】　(1)分解者　(2)鉴别　将蛋白胨改成尿素　酚红　(3)灭菌　消毒　(4)稀释涂布平板法　平板划线法　菌落 ‎2．常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答：‎ ‎(1)微生物实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是_______________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该将器皿________________________。‎ ‎　‎ 图1　　　　　　　　　　　　　　　图2‎ ‎(2)制备酵母菌培养基要进行平板操作，待平板冷凝后，要将培养皿倒置，其主要原因___________________。‎ ‎(3)取从自然界中采集的葡萄，然后在超净台上将葡萄置于0.1%氯化汞水溶液中进行表面消毒5 min，再用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后进行纯化培养。研究者在经过接种后得到了一个经培养后菌落分布如图1所示的平板，推测接种时可能的操作失误是________________________。为了确定培养基是否被污染，需要进行的操作是：_____________________。‎ ‎(4)下表为某学生在筛选培养能利用木糖发酵的酵母菌时所配置的培养基配方，请指出其中的明显不足之处________________________________。‎ K2HPO4‎ FeSO4‎ MgSO4·7H2O NaNO3‎ KCl 蔗糖 木糖 琼脂 蒸馏水 ‎0.1 g ‎0.001 g ‎0.05 g ‎0.3 g ‎0.05 g ‎3.0 g ‎3.0 g ‎2.0 g ‎100 mL ‎【解析】　(1)微生物实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是高压蒸汽灭菌、干热灭菌。将培养皿放入灭菌锅之前通常用牛皮纸或报纸包扎避免灭菌后的再次污染。‎ ‎(2)待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染。‎ ‎(3)观察上图1可知，培养后菌落分布不均匀，可能是接种时涂布不均匀造成的。为了确定培养基是否被污染，可以培养空白平板以作为对照。‎ ‎(4)表格中有蔗糖、木糖两种碳源，而筛选培养能利用木糖发酵的酵母菌时，应该以木糖为唯一碳源。‎ ‎【答案】　‎ ‎(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌　用牛皮纸包扎　(2)防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染　(3)涂布不均匀　培养空白平板　(4)应该以木糖为唯一碳源 ‎　　　　　两种接种方法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落 优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征 缺点 不能计数 较麻烦，平板不干燥效果不好 适用范围 适用于好氧菌 适用于厌氧菌和兼性厌氧菌 考点二| 微生物的分离与计数 ‎1．分离特定微生物的知识准备 ‎(1)区分涂布平板法和混合平板法 ‎①区分两种平板法过程图 ‎②结果不同 a．涂布平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。‎ b．混合平板法：细菌菌落出现在平面表面及内部。‎ ‎③目的相同：分离各种目的微生物。‎ ‎(2)选择培养分离 ‎①方法：针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。‎ ‎②原理：不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。‎ ‎③用途：从众多微生物中分离出特定的微生物。‎ ‎(3)菌落 ‎①概念：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。‎ ‎②特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。‎ ‎2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ‎(1)培养基 采用唯一氮源为尿素的培养基。‎ ‎(2)统计菌落数目 统计样品中的活菌一般用涂布平板法。‎ ‎(3)实验流程 土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。‎ ‎3．纤维素分解菌的筛选 ‎(1)原理 ‎　　　　　　　　 纤维素分解菌 ‎　　　　　　　　　　　　↓‎ ―→红色复合物红色消失，出现透明圈。‎ ‎(2)筛选方法：刚果红染色法。‎ ‎(3)标志：以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。‎ ‎(4)实验流程 土壤取样：富含纤维素的环境 ‎　 ↓‎ 选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度 ‎　 ↓‎ 梯度稀释：制备系列稀释液 ‎　 ↓‎ 涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 ‎　 ↓‎ 挑选产生：透明圈的菌落 ‎4．显微镜直接计数法 ‎(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。‎ ‎(2)缺点：不能区分死菌还是活菌。‎ ‎(3)1 mL培养液中菌体的总数换算公式为：‎ ‎①16×25型的血球计数板：1 mL悬液中待测标本(菌体)数＝×400×104×稀释倍数。‎ ‎②25×16型的血球计数板：1 mL悬液中待测标本(菌体)数＝×400×104×稀释倍数。‎ 视角1 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ‎1．(2016·四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。‎ ‎(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。‎ ‎(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。‎ 该过程采取的接种方法是______，每克土壤样品中的细菌数量为______×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。‎ ‎(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。‎ ‎【解析】　(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。‎ ‎【答案】　(1)尿素　酚红　红　(2)稀释涂布平板法 ‎1．75　少　(3)UGA　115‎ 视角2 分解纤维素的微生物的分离 ‎2．(2014·全国卷Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：‎ ‎(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。‎ ‎(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。‎ ‎(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：‎ 酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 CR溶液 水 培养基甲 ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎－‎ ‎＋‎ ‎＋‎ 培养基乙 ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎－‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ 注：“＋”表示有，“－”表示无。‎ 据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________；‎ 培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_________________________________。‎ ‎【解析】　(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。‎ ‎【答案】　(1)纤维二糖　葡萄糖　(2)红　透明圈 ‎(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌 选择培养基和鉴别培养基的总结 类型 实例 选择培养基 培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌 培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌 以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌 不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物 石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的 培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物 鉴别培养基 伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈深紫色并带金属光泽)‎ 真题验收| 感悟高考　淬炼考能 ‎1．(2016·全国乙卷)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：‎ ‎①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；‎ ‎②制作无菌平板；‎ ‎③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；‎ ‎④将各组平板置于‎37 ℃‎恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。‎ ‎(2)步骤③中，实验组的操作是________。‎ ‎(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。‎ ‎【解析】　(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。‎ ‎【答案】　(1)牛肉膏、蛋白胨　琼脂　(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间　(3)污染　不正确 ‎2．(2016·全国丙卷)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：‎ ‎(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是____________________。‎ ‎(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________和________。分离纯化时应挑选出________的菌落作为候选菌。‎ ‎(3)乳酸菌在－‎20 ℃‎长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。‎ ‎【解析】　(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。(2)乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。(3)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3 mL的甘油瓶中，装入1 mL甘油后灭菌。将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－‎20 ℃‎的冷冻箱中保存。‎ ‎【答案】　(1)无菌水　泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落　(2)鉴别乳酸菌　中和产生的乳酸(或酸)　具有透明圈　(3)甘油 ‎1．掌握无菌操作技能是进行微生物分离与培养的基础；掌握微生物培养基的配制技术和微生物接种和培养的方法是实现微生物分离和培养的必要条件。‎ ‎2．灭菌主要包括干热灭菌和湿热灭菌，前者在干热灭菌箱内进行，后者常用高压蒸汽灭菌锅进行。‎ ‎3．培养基的制备包括计算、称量、熔化、灭菌、倒平板等步骤，平板倒置的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。‎ ‎4．微生物接种常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。‎ ‎5．统计菌落数目的方法有显微镜直接计数法和间接计数法。‎ 微生物的间接计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。‎ ‎6．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。‎ ‎7．植物组织培养包括脱分化和再分化等过程，培养过程除了需要各种营养物质外，还需要植物激素的调节。‎