【生物】2019届一轮复习人教版第39讲　无菌操作技术实践教案

【生物】2019届一轮复习人教版第39讲　无菌操作技术实践教案

第39讲　无菌操作技术实践 ‎[考纲要求]　1.微生物的分离和培养(B)。2.某种微生物数量的测定(C)。3.微生物的应用(B)。4.实验：微生物的分离与培养(b)。‎ 考点一　微生物的分离和培养 ‎1．相关技能、技术和方法 ‎(1)无菌操作的技能 ‎①干热灭菌法是指将准备灭菌的物品放在干热灭菌箱内，在160～170 ℃下加热1～2 h以达到灭菌的目的。‎ ‎②湿热灭菌法常采用高压蒸汽灭菌锅进行，其使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步骤。‎ ‎(2)培养基的配制 ‎①培养基的概念：是为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。‎ ‎②营养组成：一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等最基本的物质。此外，根据拟培养的微生物的不同需要，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基中pH使之满足微生物生长的需要。‎ ‎③种类：天然培养基和合成培养基，前者的主要优点是取材便利、营养丰富、配制简便，缺点是营养成分难以控制、实验结果的重复性较差；后者的优点是化学成分及其含量明确，实验的可重复性好，缺点是配制繁琐、成本较高。‎ ‎(3)微生物的接种 ‎①接种：是指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。‎ ‎②常用的工具有玻璃涂布器、接种针、接种环等，在涂布平板接种时要用玻璃涂布器，穿刺接种时要用接种针，在斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种时要用接种环。‎ ‎2．大肠杆菌的接种与分离培养 ‎(1)配制牛肉膏蛋白胨培养基 其操作步骤：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。‎ ‎(2)斜面接种和培养大肠杆菌 ‎①主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。‎ ‎②主要步骤：准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37_℃恒温箱中培养大肠杆菌24 h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4 ℃)保存。‎ ‎(3)平板划线分离和培养大肠杆菌 ‎①平板制作的方法及注意事项 a．请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。‎ b．甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。‎ c．丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。‎ ‎②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。‎ 易混辨析　消毒和灭菌 项目 条件 结果 常用方法 应用范围 消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 煮沸消毒法 日常用品 巴氏消毒法 不耐高温的液体 化学药剂消毒法 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源 灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具 干热灭菌法 玻璃器皿、金属工具 高压蒸汽灭菌法 培养基及容器的灭菌 ‎(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(　√　)‎ ‎(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　×　)‎ ‎(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(　√　)‎ ‎(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　×　)‎ ‎(5)用涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(　√　)‎ 如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：‎ ‎(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？‎ 提示　获得效果A的接种方法为涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。‎ ‎(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？‎ 提示　最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。‎ ‎(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？‎ 提示　火焰附近存在着无菌区域。‎ 命题点一　微生物的培养和无菌技术分析 ‎1．下表为某培养基的配方，下列叙述错误的是(多选)(　　)‎ 成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4‎ 伊红 美蓝 蒸馏水 含量 ‎10 g ‎10 g ‎2 g ‎0.4 g ‎0.065 g ‎1 000 mL A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基 B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨 C．该培养基缺少提供生长因子的物质 D．该培养基调节合适的pH后就可以接种使用 答案　ACD 解析　分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数微生物最常利用的碳源，B项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C项错误；培养基调节完pH还要进行灭菌等操作后才能使用，D项错误。‎ ‎2．(2018·淮安调研)微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。‎ 现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(　　)‎ ‎①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢 ‎②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ‎③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒 ‎④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 ‎⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌 ‎⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 A．①③ B．②④‎ C．③⑤ D．④⑥‎ 答案　D 解析　无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种操作要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。‎ ‎3．高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。请据图回答下列问题：‎ ‎(1)Ⅰ号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入________________作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以________________作为唯一碳源。‎ ‎(2)配制固体培养基的基本步骤是(　　)‎ A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板 ‎(3)溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地____________，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为____________________。‎ ‎(4)①过程是________________，②过程所使用的接种方法是________________法。‎ ‎(5)部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到Ⅱ号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行________________培养。‎ 答案　(1)琼脂　淀粉　(2)C　(3)搅拌　高压蒸汽灭菌 (4)稀释　涂布平板　(5)淀粉酶　扩大 解析　(1)固体培养基通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得产生高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。(2)配制固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(3)配制培养基加热溶化时，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。(4)仔细观察题图可知过程，①是菌液稀释过程，②是采用涂布平板法接种。(5)能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以对菌种进行扩大培养用于生产。‎ ‎1．培养基的配制原则 ‎(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。‎ ‎(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。‎ ‎(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。‎ ‎2．微生物对主要营养物质的需求特点 ‎(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。‎ ‎(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。‎ 命题点二　大肠杆菌的纯化方法及过程分析 ‎4．下图中甲是涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。‎ 下列叙述中错误的是(　　)‎ A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液 B．对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成 C．乙培养皿中所得的菌落都符合要求 D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端 答案　C 解析　灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A项正确；稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B项正确；平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C项错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使菌体的密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成的，D项正确。‎ ‎5．牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图1所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：‎ ‎(1)巴氏消毒的方法是__________________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是__________________。‎ ‎(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图2中的__________________。‎ ‎(3)图1中所示方法为涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为__________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值_________(填“偏大”或“偏小”)，原因是____________________________________________________。‎ ‎(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？__________________。‎ ‎(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，‎ 从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入__________，菌落具有____________________特征的可以认定为大肠杆菌。‎ 答案　(1)在70～75 ℃煮30 min(或在80 ℃煮15 min)　牛奶的营养成分不被破坏　(2)B　(3)3.4×106　偏小　个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的　(4)减少稀释次数　(5)伊红美蓝　(金属光泽的紫)黑色 解析　(1)巴氏消毒的方法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。(2)涂布使用的工具是涂布器，图B正确。(3)菌落的平均数是34个，生牛奶中每毫升含细菌数＝菌落平均数/涂布量×稀释倍数＝34个/0.1 mL×104＝3.4×106个/mL。在统计菌落时，当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，所以可减少稀释次数。(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。‎ 考点二　分离特定的微生物并测定其数量 ‎1．区分涂布平板法和混合平板法 ‎(1)过程如图 ‎(2)结果不同 ‎①涂布平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。‎ ‎②混合平板法：细菌菌落出现在平板表面及内部。‎ ‎(3)目的相同：分离各种目的微生物。‎ ‎2．选择培养分离 ‎(1)方法：针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。‎ ‎(2)原理：不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。‎ ‎(3)用途：从众多微生物中分离出特定的微生物。‎ ‎3．菌落 ‎(1)概念：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。‎ ‎(2)特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。‎ ‎4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ‎(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。‎ ‎(2)统计菌落数目一般用涂布平板法。‎ ‎①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。‎ ‎②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。‎ ‎③利用涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。‎ ‎(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。‎ ‎5．分解纤维素的微生物的分离 ‎(1)土壤中能分解纤维素的微生物种类很多，有细菌、真菌等，它们能分泌纤维素酶，将纤维素分解成小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要，同时也能改善土壤的结构，提高土壤的肥力。‎ ‎(2)纤维素分解菌的筛选 ‎①原理 ‎　　　　　　　　纤维素分解菌 ‎　　　　　　　　　　　↓‎ →红色复合物红色消失，出现透明圈 ‎②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。‎ ‎③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。‎ ‎④实验流程 土壤取样：富含纤维素的环境 ‎↓‎ 选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度 ‎↓‎ 梯度稀释：制备系列稀释液 ‎↓‎ 涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 ‎↓‎ 挑选产生透明圈的菌落 ‎6．显微镜直接计数法 ‎(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。‎ ‎(2)缺点：不能区分死菌还是活菌。‎ ‎(3)1 mL培养液中菌体的总数换算公式为：‎ ‎①16×25型的血球计数板：1 mL悬液中待测标本(菌体)数＝×400×104×稀释倍数。‎ ‎②25×16型的血球计数板：1 mL悬液中待测标本(菌体)数＝×400×104×稀释倍数。‎ ‎(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(　×　)‎ ‎(2)对细菌进行计数只能采用涂布平板法，而不能用平板划线法(　×　)‎ ‎(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(　√　)‎ ‎(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(　×　)‎ ‎(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(　×　)‎ 研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示，将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图2，请分析：‎ ‎(1)透明圈是如何形成的？‎ 提示　刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解，形成透明圈。‎ ‎(2)图中透明圈大小代表什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？‎ 提示　透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株①。‎ ‎(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？‎ 提示　J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。‎ 命题点一　选择培养基成分及配制方法的分析 ‎1．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(　　)‎ A．伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基 B．含青霉素的培养基、含氨的无机培养基 C．含氨的无机培养基、含青霉素的培养基 D．含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基 答案　B 解析　酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸过程所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行硝化细菌的选择培养。‎ ‎2．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请据图回答下列问题：‎ ‎(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基 ‎______________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______________________法。‎ ‎(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于__________ _________________________________；使用__________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是_____________________________ ___________________________________________。‎ ‎(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？‎ ‎________________________________________________________________________。‎ 答案　(1)苯酚　影响　涂布平板菌落计数　(2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源　涂布平板法或平板划线　防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基　(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作 解析　(1)选择降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用涂布平板菌落计数法来测定②中活菌数目。‎ ‎(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源；使用布平板法或平板划线法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。‎ ‎(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。‎ 选择培养基的制作方法 ‎(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。‎ ‎(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。‎ ‎(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物生长，使能够利用石油的微生物生长，从而分离出能消除石油污染的微生物。‎ ‎(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。‎ 命题点二　微生物的分离与计数 ‎3．植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：‎ ‎(1)分解秸秆中纤维素的微生物种类很多，有________等。它们能分泌纤维素酶，将纤维素分解成小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要，同时也能改善土壤的结构，提高土壤的肥力。‎ ‎(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的______________。‎ ‎(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：‎ 酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 CR溶液 水 培养基甲 ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎－‎ ‎＋‎ ‎＋‎ 培养基乙 ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎－‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ 注：“＋”表示有，“－”表示无。‎ 据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是__________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ 答案　(1)细菌、真菌　(2)红　透明圈　(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌 解析　(1)土壤中能分解纤维素的微生物种类很多，有细菌、真菌等。(2)刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。‎ ‎4．(2017·徐州调研)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：‎ ‎(1)该小组采用涂布平板法检测水样中细菌的含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_______________________________________ ‎ ‎_________________________________；‎ ‎(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环需通过________________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是________________________________________________________________________。‎ ‎(3)示意图A和B中，________________表示的是用涂布平板法接种培养后得到的结果。‎ ‎(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中__________________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________________的利用率。‎ 答案　(1)检测培养基平板灭菌是否合格　(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落　(3)B　(4)溶解氧　营养物质 解析　(1)在涂布接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(2)用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环需通过灼烧灭菌，在第二次及以后的划线时，应从上一次划线末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)涂布平板法接种培养后得到的结果应为图B。(4)振荡可以使细菌分散，更有利于细菌利用培养液中的营养物质，并且可以使培养液中的溶解氧增多。‎ 两种纯化细菌方法的辨析 比较项目 平板划线法 涂布平板法 关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 ‎①一系列的梯度稀释②涂布平板法操作 注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围 菌体获取 在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数 缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板 矫正易错　强记长句 ‎1．灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。‎ ‎2．划线时最后一区不要与第一区相连。‎ ‎3．划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。‎ ‎4．用涂布平板菌落计数法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。‎ ‎5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。‎ 下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：‎ ‎1．图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。‎ ‎2．接种操作要在火焰附近进行的原因是火焰附近存在着无菌区域。‎ ‎3．接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。‎ 重温高考　演练模拟 ‎1．(2015·江苏，19)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(　　)‎ A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖 B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上 答案　D 解析　A项错，高压灭菌加热结束后，让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物；B项错，倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖；C 项错，灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；D项对，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。‎ ‎2．空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：‎ ‎①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；‎ ‎②制作无菌平板；‎ ‎③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；‎ ‎④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。‎ ‎(2)步骤③中，实验组的操作是_____________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。‎ 答案　(1)牛肉膏、蛋白胨　琼脂　(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 (3)污染　不正确 解析　(1)牛肉膏和蛋白胨都含有蛋白质的水解产物，都可以作为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内“不同高度空气”中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。‎ ‎3．(2017·江苏，31)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：‎ ‎(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有________________________________________________________________________。‎ ‎(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。‎ ‎(3)下图为连续划线法示意图，在图中________(填图中序号)区域更易获得单菌落。‎ ‎(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5 号比色管的苯酚浓度应分别为____________________。‎ 管号 ‎1‎ ‎2‎ ‎3‎ ‎4‎ ‎5‎ ‎6‎ 苯酚浓度/(mg·L－1)‎ ‎1‎ 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21% 的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5　②10　③20)倍后，再进行比色。‎ 答案　(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀释涂布　凝固剂 (3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8　③‎ 解析　(1)含碳有机物如蛋白胨、苯酚均可作为异养型细菌的碳源。‎ ‎(2)为达到富集苯酚降解菌的目的，培养过程中随转接次数增加，应逐渐提高苯酚用量。若平板中菌落过于密集，为便于分离与计数，应进一步稀释涂布；进行分离计数应制备“固体”培养基，故平板培养基中除需水、营养物质外，还需添加凝固剂。‎ ‎(3)连续划线法分离菌种时，在最后的划线区，菌种分散最充分，最宜获得单菌落。‎ ‎(4)制作系列浓度梯度进行显色反应应设置无菌水作对照组(苯酚浓度为0)，并设置等差密度梯度，故1～5苯酚浓度依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8。若废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则残留液中苯酚浓度为10.5 mg/L，宜将其稀释20倍方可达到适宜比色管苯酚浓度。‎ ‎1．(2018·苏州质检)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是(　　)‎ A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中 B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上 C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上 D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上 答案　C 解析　‎ 在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外植体的生长，甚至杀死外植体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果影响也不会太大。‎ ‎2．(2017·张家港检测)下列有关微生物培养与应用的说法，不正确的是(多选)(　　)‎ A．天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基 B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理 C．大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段 D．分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源 答案　ABD 解析　天然培养基是指用天然物质制成的培养基，但也需要加工，A项错误；实验操作者的双手应消毒，不是灭菌，B项错误；分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源，不是碳源，需加入不含氮元素的有机物(如葡萄糖)作为碳源，D项错误。‎ ‎3．下面是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是(　　)‎ A．在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌 B．划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上 C．接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的 D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数 答案　C 解析　在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，但不能对培养基进行灭菌；进行划线操作时，左手将培养皿的皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。‎ ‎4．下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是(　　)‎ A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 B．筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质 C．统计样品中的活菌数目一般用平板划线法 D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌 答案　A 解析　只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，A 项正确；筛选分解尿素的细菌的实验中，采用的是以尿素为唯一氮源的培养基，B项错误；统计样品中的活菌数目一般用涂布平板法，C项错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素，D项错误。‎ ‎5．(2013·江苏，15)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是(　　)‎ A．培养基分装到培养皿后进行灭菌 B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线 C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养 D．培养过程中每隔一周观察一次 答案　B 解析　培养基灭菌后再分装到培养皿中，A项错误；转换划线角度后要灼烧接种环，冷却后再从上次划线的末端开始进行划线，B项正确；接种后的培养皿必须放在恒温箱中进行培养，C项错误；培养过程中一般每隔12 h或24 h观察一次，D项错误。‎ ‎6．大肠杆菌是与我们日常生活联系非常密切的细菌，请回答有关检测饮用水中大肠杆菌的问题：‎ ‎(1)检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数，这种方法称为____________________。‎ 判断下面所示的4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是______________。‎ ‎(2)用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？____________________(填“需要”或“不需要”)，其原因是需要判断培养基____________________，对于固体培养基应采用的检测方法是将____________________的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。‎ ‎(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________________(填“消毒”或“灭菌”)处理；操作者的双手需要进行清洗和____________；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使其内蛋白质变性，还能损伤它的____________结构。‎ ‎(4)检测大肠杆菌实验结束后，使用过的培养基及其培养物必须经过____________________处理才能丢弃，以防止培养物的扩散。‎ 答案　(1)涂布平板法　D　(2)需要　是否被杂菌污染(灭菌是否合格)　未接种　(3)灭菌　消毒　DNA (4)灭菌 解析　D中菌落分布情况为平板划线法所得。为判断培养基是否被杂菌污染(灭菌是否合格)‎ ‎，本实验需要设置对照组。可将未接种的培养基在适宜的温度条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生，若发现有菌落说明培养基已被污染。消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对培养基和培养器皿进行灭菌处理，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒。‎ ‎7．现在国家大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地产生大量废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源——乙醇。下图是工业上利用微生物分解纤维素生产乙醇的基本工艺流程，请回答相关问题：‎ ‎(1)将从土壤中获得的微生物培养在以________为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，为了得到单一菌落，常采用的接种方法有两种，即____________和____________。‎ ‎(2)在含纤维素的培养基中通常加入__________染料，此染料可与纤维素形成________色复合物。用含有此染料的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。我们可以通过此方法来筛选纤维素分解菌。‎ 答案　(1)纤维素　平板划线法　涂布平板法 (2)刚果红　红　透明圈 解析　(1)要从土壤中获得能分解纤维素的微生物，需要将土壤中获得的微生物培养在以纤维素为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，常用的接种方法有平板划线法和涂布平板法。‎ ‎(2)在培养基中加入刚果红染料，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。‎ ‎8．(2015·全国Ⅰ，39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：‎ ‎(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用______________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。‎ ‎(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。‎ ‎(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用____________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用____________________法进行计数。‎ ‎(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，________ ℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________ ℃设计后续实验。‎ 答案　(1)苏丹Ⅲ染色液　萃取法　(2)油脂　(3)血球计数板　涂布平板菌落计数　(4)45　40‎ 解析　(1)生物组织中的油脂能被苏丹Ⅲ染色液染成橘黄色。(2)为了筛选出能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，我们应选用只能让该菌落生长的选择培养基，因此只能选用以油脂作为唯一碳源的固体培养基。(3)血球计数板可用于直接计数培养液中的菌体数，但是不分死活，因此要计数活菌数量要通过涂布平板菌落计数法来计数。(4)温度影响酶的活性，在三个温度中，45 ℃需酶量最多，说明酶活性最低；40 ℃所需酶量最少，说明酶活性最高，因此应围绕40 ℃设计不同温度梯度，进行后续实验。‎