2020-2021学年高二生物人教版选修1学案：专题5　课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 Word版含解析

2020-2021学年高二生物人教版选修1学案：专题5　课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 Word版含解析

www.ks5u.com 课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 知识点一　　　　　　　　PCR原理及反应过程 ‎1．PCR的原理 ‎(1)概念：PCR是多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。‎ ‎(2)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。‎ ‎(3)引物 ‎①本质：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。‎ ‎②需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。‎ ‎(4)原理 DNA的热变性原理，即双链DNA 单链DNA。‎ ‎(5)反应条件：①一定的缓冲溶液；②DNA模板；③分别与两条模板链相结合的两种引物；④四种脱氧核苷酸；⑤耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶；⑥能严格控制温度变化的温控设备。‎ ‎2．PCR的反应过程 ‎(1)过程 ‎①变性：当温度上升到‎90 ℃‎以上时，双链DNA解聚为单链。‎ ‎②复性：温度下降到‎50 ℃‎左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。‎ ‎③延伸：当温度上升到‎72 ℃‎左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。‎ ‎(2)结果 ‎①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。‎ ‎②两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。‎ 注意：①可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列来设计引物；②设计引物时，引物太短会降低PCR的特异性；③引物自身及两种引物之间不应存在互补序列；④扩增过程中，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段；⑤扩增n次后，含某种引物的DNA片段数为2n－1。‎ 细胞内DNA复制与PCR技术的比较 PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，与细胞内DNA复制的过程相比既有相同点又有不同点，通过列表比较的方法准确掌握两者的异同，是防止此类问题出错的重要措施。‎ 细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较：‎ ‎【典题精练1】　多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历三十多次下述循环：‎95 ℃‎下变性(使模板DNA解旋)→‎55 ℃‎下复性(引物与DNA模板链结合)→‎‎72 ℃‎ 下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述不正确的是(　　)‎ A．在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现 B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高 ‎【答案】　C ‎【解析】　变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。‎ 解题归纳 细胞内参与DNA复制的组分和基本条件及其作用 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供DNA复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶、DNA聚合酶 打开DNA双螺旋、催化合成DNA子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为DNA聚合酶提供合成的3′端起点 ‎【典题精练2】　下列关于DNA复制的叙述，正确的是(　　)‎ A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链 B．DNA复制不需要引物 C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 D．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸 ‎【答案】　C ‎【解析】　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链；子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链的5′端向3′端延伸。‎ 知识点二　　　　　　　　PCR的实验操作、结果分析与评价 ‎1．实验操作 ‎(1)实验用具 ‎①PCR仪：参照下表设计循环程序。‎ 变性 复性 延伸 预变性 ‎94 ℃‎‎，5 min ‎——‎ ‎——‎ ‎30次 ‎94 ℃‎‎，30 s ‎55 ℃‎‎，30 s ‎72 ℃‎‎，1 min 最后1次 ‎94 ℃‎‎，1 min ‎55 ℃‎‎，30 s ‎72 ℃‎‎，1 min 提示：若无PCR仪可用恒温水浴锅代替。‎ ‎②微量离心管：是一种薄壁塑料管，总容积为0.5 mL。‎ ‎③微量移液器：用于定量转移PCR反应体系配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。‎ ‎(2)操作步骤 ‎①准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上。‎ ‎②移液：用微量移液器按配方向微量离心管中依次加入各组分。‎ ‎③混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。‎ ‎④离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10‎ ‎ s，目的是使反应液集中在离心管底部。‎ ‎⑤反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。‎ ‎2．结果分析与评价 DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下。‎ ‎(1)稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。‎ ‎(2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。‎ ‎(3)测定：取步骤(1)中的DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。‎ ‎(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。‎ 注意：如果扩增不成功，可能的原因有漏加了PCR的反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。‎ ‎1．PCR实验中的注意事项 ‎(1)避免外源DNA污染：所用的器材、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。‎ ‎(2)缓冲液和酶应分装成小份，在－‎20 ℃‎储存。‎ ‎(3)每添加一种反应成分，应更换一个移液器的枪头。‎ ‎(4)混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。‎ ‎2．PCR反应中对照实验的设置 探究目的 实验组 对照组 PCR反应需要四种脱氧核苷酸 加四种脱氧核苷酸 不加四种脱氧核苷酸 PCR反应需要两种引物 加两种引物 不加两种引物 PCR反应需要DNA模板 加DNA模板 不加DNA模板 PCR反应需要Taq DNA聚合酶 加Taq DNA聚合酶 不加Taq DNA聚合酶 ‎【典题精练3】　在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是(　　)‎ A．Taq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制 B．系统设计欠妥 C．循环次数不够 D．引物不能与亲链结合 ‎【答案】　D ‎【解析】　如果Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少，A项正确。如果PCR系统设置不妥，也达不到预期的结果，B项正确。如果循环次数过少，产物的量比预期的少，C项正确。如果引物设计不合理，也许不能与模板DNA结合，造成无法进行扩增，而结果得到了210个DNA分子，则D项错误。‎ 解题归纳 做该类题目的关键是掌握在PCR扩增过程中，每一步不同的处理都可能导致错误，影响DNA的扩增。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。‎ ‎【典题精练4】　下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　)‎ A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B．PCR使用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 C．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－‎20 ℃‎储存 D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换 ‎【答案】　B ‎【解析】　在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，不能迅速融化。‎ 一、选择题 ‎1．DNA的复制需要引物，其主要原因是(　D　)‎ A．可加快DNA的复制速度 B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链 D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链 解析：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。‎ ‎2．下图表示DNA变性和复性示意图，下列相关说法正确的是(　A　)‎ A．向右的过程为加热(80～‎100 ℃‎)变性的过程 B．向左的过程是DNA双链迅速致冷复性 C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同 D．图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3′端 解析：向左为缓慢冷却复性；变性是在‎90°C以上时，DNA双链解旋为单链，这一过程在生物体内需解旋酶；图中DNA片段有两个游离磷酸基，2个3′端。‎ ‎3．有关PCR技术，下列叙述不正确的是(　C　)‎ A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术 B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似 C．PCR反应只需在一定的缓冲溶液中进行，需提供：DNA模板以及四种脱氧核苷酸 D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸 解析：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。‎ ‎4．下列有关PCR技术的说法不正确的是(　A　)‎ A．PCR技术是在细胞内完成的 B．PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术 C．PCR技术的原理与DNA复制的原理相同 D．PCR技术的前提是有一段已知的目的基因的核苷酸序列 解析：PCR技术是在生物体外进行DNA复制的技术，其原理与DNA复制的原理相同，但前提是必须要有一段已知的目的基因的核苷酸序列和根据核苷酸序列合成的引物。‎ ‎5．下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　D　)‎ A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上 B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．该技术需要一对特异性的引物，且要求这一对引物的序列是互补的 D．该技术应用体内DNA复制的原理，也需要模板、原料、酶等条件 解析：利用PCR技术进行DNA扩增时，目的基因的序列可以不是已知的，A错误；由于PCR反应需要在高温条件下进行，因此需要耐热的DNA聚合酶，但PCR过程中DNA的解旋是通过控制温度实现的，不需要解旋酶，B错误；PCR反应中的引物可分别与两条模板链相结合，这对引物的序列不需要互补，C错误；PCR技术应用了细胞内DNA复制的原理，也需要DNA模板、原料(4种脱氧核苷酸)、酶(如Taq DNA聚合酶)等条件，D正确。‎ ‎6．下列有关DNA含量测定的叙述，错误的是(　C　)‎ A．可利用DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰这一特点来进行DNA含量的测定 B．测定时通常需要对样品进行稀释 C．直接将样品放在波长260 nm处，测定其光吸收值 D．可利用“DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数”来计算样品中的DNA含量 解析：对样品进行测定前要以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零，而不能直接测定样品的光吸收值。‎ 二、非选择题 ‎7．近年来，PCR(多聚酶链式反应)技术已成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。‎ ‎(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开氢键，称为变性。‎ ‎(2)当温度缓慢降低时，引物与模板3′端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子。此过程中，原料是四种脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。‎ ‎(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个，即液体环境、适宜的温度和酸碱度，前者由PCR仪自动调控，后者则靠缓冲溶液来维持。‎ ‎(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用含15N标记的模板DNA分子放入试管中，以含14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制三次后，则含15N标记的DNA链占全部DNA总单链数的比例为1/8。‎ 解析：本题考查体内DNA复制与PCR技术的原理以及基本条件。(1)PCR技术中第一步是利用高温使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需要的原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。(3)PCR技术与细胞内DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、ATP、酶以外，还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度。适宜的温度靠PCR仪自动调控，酸碱度靠缓冲溶液来维持。(4)DNA的复制方式为半保留复制。1个DNA分子连续复制三次产生23＝8个DNA分子，共16条单链。含15N标记的DNA链共有2条，所占比例为2/16＝1/8。‎ ‎8．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份相同的DNA片段。请根据所学知识回答下列有关PCR技术的基本原理和应用的问题。‎ ‎(1)PCR的原理：在80～‎100 ℃‎的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，称为复性。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。‎ ‎(2)20世纪80年代，科学家从水生耐热细菌Taq中分离得到耐高温的Taq_DNA聚合酶，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，使PCR技术趋向自动化。实验室中微生物的筛选所应用的原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长，其中用于筛选目的菌株的培养基称为选择培养基。‎ ‎(3)PCR反应的条件：稳定的缓冲液环境、DNA模板、分别与两条模板链结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、能严格控制温度变化的温控设备等。‎ ‎(4)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。如果在PCR反应中只有一个DNA片段作为模板，在6次循环后，反应体系中共有64个DNA分子。‎ ‎(5)简述目前PCR技术的具体应用(至少答两点)：遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆、DNA序列测定等(答案合理即可)。‎ 解析：(1)PCR过程包括高温变性(解链)、低温复性、中温延伸三个步骤。在80～100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又重新结合成双链，这个过程称为复性。由此看出PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。(2)PCR反应需要在高温下进行，所以需要耐高温的DNA聚合酶。用于筛选目的菌株的培养基为选择培养基。(3)PCR反应的条件包括一定的缓冲溶液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物、耐热的DNA聚合酶以及能严格控制温度变化的温控设备等。(4)PCR的每次循环可以分为变性、复性和延伸三步；从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应。以一个DNA片段为模板，在6次循环后反应体系中的DNA分子数是26＝64。(5)PCR技术有广泛的应用，可以用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆、DNA序列测定等方面。‎ ‎1．提示：绘图可参考教科书中图5—9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段(2n＝230＝1 073 741 824)。‎ ‎2．提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》(见本专题参考书目)，书中有详尽的论述。‎