【生物】2019届一轮复习人教版第34讲　基因工程学案

【生物】2019届一轮复习人教版第34讲　基因工程学案

‎● 选修3　现代生物科技专题 ●‎ 第十单元　现代生物科技专题 第34讲　基因工程 ‎[考纲明细]　1.基因工程的诞生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)　3.基因工程的应用(Ⅱ)　4.蛋白质工程(Ⅰ)　5.实验：DNA的粗提取与鉴定 考点1　基因工程的操作工具 ‎ 1.基因工程概念 ‎2.限制酶 ‎(1)存在：主要存在于原核生物中。‎ ‎(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。‎ ‎(3)形成末端类型 ‎3.DNA连接酶 ‎(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。‎ ‎(2)种类 ‎ (3)DNA连接酶和限制酶的关系 ‎4.载体 ‎(1)条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切割位点；具有标记基因。‎ ‎(2)种类 ‎(3)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。‎ ‎(4)特点：可在受体细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。‎ ‎1.深挖教材 ‎(1)基因工程两种工具酶及质粒的化学本质分别是什么？‎ 提示　限制酶、DNA连接酶其化学本质均为蛋白质。质粒为环状DNA分子。‎ ‎(2)限制酶为何不切割自身DNA？‎ 提示　限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。‎ ‎2.判断正误 ‎(1)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)‎ ‎(2)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)‎ ‎(3)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×)‎ ‎(4)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)‎ ‎(5)DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来(×)‎ 题组一　基因工程工具酶分析 ‎1.如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是(　　)‎ A．HindⅢ B．EcoRⅠ C．EcoB D．PstⅠ 答案　C 解析　A处有BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ限制酶的切点，使用A～D中的EcoB切割时，才能让目的基因插入到A处。‎ ‎2.(2016·全国卷Ⅲ)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau‎3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau‎3AⅠ的切点是唯一的)。‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________。‎ ‎(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图c所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是___________________________________________________。‎ 图c ‎(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________________。‎ 答案　(1)Sau‎3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 ‎(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)‎ ‎(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(其他合理答案也可)‎ 解析　(1)分析图a可知，限制酶Sau‎3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。‎ ‎(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。‎ ‎(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。‎ 技法提升 归纳与DNA相关的六种酶 题组二　载体的作用及特点 ‎3.(2016·全国卷Ⅰ) 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：‎ ‎(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。‎ ‎(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其 原因是___________________________________；并且_____________________________和__________________________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________。‎ 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________________________的固体培养基。‎ ‎(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于______________________。‎ 答案　(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)‎ ‎(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素 ‎(3)受体细胞 解析　(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。‎ ‎(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。‎ ‎(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。‎ 考点2　基因工程的基本程序 ‎1.目的基因的获取 ‎(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。‎ ‎ (3)几种目的基因获取方法的比较 ‎(4)PCR技术的原理和反应过程 ‎①PCR原理：DNA双链复制 ‎②PCR反应过程 ‎③结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。‎ ‎2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 ‎(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。‎ ‎(2)基因表达载体的组成 ‎(3)构建过程 ‎3．将目的基因导入受体细胞 ‎4．目的基因的检测与鉴定 ‎(1)分子水平的检测 ‎①利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。‎ ‎②利用分子杂交技术检测目的基因的转录。‎ ‎③利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译。‎ ‎(2)个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。‎ ‎1．深挖教材 获取目的基因与切割载体时只能用同一种限制酶吗？‎ 提示　①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。‎ ‎②为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。‎ ‎2．判断正误 ‎(1)用逆转录法构建的cDNA文库不具有内含子，但有启动子与终止子(×)‎ ‎(2)检测受体细胞是否导入了目的基因，以及受体细胞中导入的目的基因是否转录出mRNA，可用相同的基因探针进行诊断(√)‎ ‎(3)目的基因插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)‎ ‎(4)基因的表达需要启动子的调控，与终止子无关(×)‎ ‎(5)受体细胞中只要有标记基因，则说明目的基因已成功导入(×)‎ 题组一　基因表达载体构建时限制酶的选择 ‎1.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau‎3AⅠ(↓GATC)‎ ‎。下列分析合理的是(　　)‎ A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C．用BglⅡ和Sau‎3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D．用EcoRⅠ和Sau‎3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 答案　D 解析　解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau‎3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。‎ ‎2．(2016·江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：‎ ‎(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌中。‎ ‎(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________________________。‎ ‎(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。‎ ‎(4)若用Sau‎3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。‎ 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA连接　感受 ‎(2)四环素　引物甲和引物丙 ‎(3)　都不能　(4)7‎ 解析　(1)由题图可知，质粒的两个标记基因中都含有BamHⅠ的切点，因此不能用BamHⅠ进行切割，结合题干及表中信息可知也不能用Sau‎3AⅠ进行切割，所以只能用质粒和目的基因中都含有切点的BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。要将重组质粒转入大肠杆菌，要先用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态。‎ ‎(2)‎ 重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，含有重组质粒的大肠杆菌能在该平板上长出菌落。要用PCR扩增目的基因，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，因为从图2中可以看出，引物甲与引物丙与模板链结合后能完成目的基因的复制。‎ ‎(3)BamHⅠ酶切的DNA末端是，BclⅠ酶切的DNA末端是，这两个末端连接后的连接部位的6个碱基对序列为 ，由于连接后的6个碱基对序列中没有BamHⅠ和BclⅠ能识别的酶切位点，故对于该部位BamHⅠ和BclⅠ都不能将其切开。‎ ‎(4)因为质粒的BamHⅠ和BclⅠ识别序列中都有Sau‎3AⅠ的识别序列和切割位点，所以用Sau‎3AⅠ切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。Sau‎3AⅠ切点及得到的7种大小不同的DNA片段情况如下：①切点在1或2或3的位置可以分别得到1种DNA分子，但其大小相同；②切点在1和2的位置可以得到2种DNA分子；③切点在1和3的位置可以得到2种DNA分子；④切点在2和3的位置可以得到2种DNA分子，故最多可能获得7种大小不同的DNA片段。‎ 技法提升 选择限制酶的方法 ‎(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ‎①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。‎ ‎②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。‎ ‎③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。‎ ‎(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 ‎①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。‎ ‎②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。‎ 题组二　PCR技术的原理及应用 ‎3.多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是(　　)‎ A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术 B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板 C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增 D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变 答案　C 解析　PCR技术是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，所需原料是脱氧核苷酸，并以指数方式扩增，B正确，C错误；应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变，D正确。‎ ‎4．(2017·江西赣州一模)黑麦草具有抗除草剂草甘磷的能力，是因为黑麦草拥有编码抗草甘磷酶的基因。科学家利用该基因通过转基因技术获得了抗除草剂草甘磷的玉米新品种，培育新品种过程中用到了PCR技术(如图所示)，请回答下列问题：‎ ‎(1)通过反转录法得到________文库，从中选取抗草甘磷酶的基因。该方法获得的目的基因缺少基因表达所需的调控序列，即________和________。‎ ‎(2)体外获得大量编码抗草甘磷酶的基因要利用PCR技术，该技术所依据的原理为________，图中物质A是________，B酶是____________________。‎ ‎(3)将目的基因导入植物细胞有多种方法，最常用的是________。‎ ‎(4)若需要对转入抗草甘磷酶的基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做________操作。‎ ‎(5)若实验结果不理想，为了提高抗草甘磷酶活性，可以通过________工程设计和改造编码抗草甘磷酶的基因。‎ 答案　(1)cDNA　启动子　终止子 ‎(2)DNA双链复制　引物　Taq酶(或“耐高温的DNA聚合酶”)‎ ‎(3)农杆菌转化法　(4)喷洒草甘磷　(5)蛋白质 解析　(1)通过反转录法得到cDNA文库，从中选取抗草甘磷酶的基因。采用反转录的方法得到的目的基因没有启动子和终止子。‎ ‎(2)体外获得大量编码抗草甘磷酶的基因要利用PCR技术，PCR技术以解开的双链作为模板，利用的原理是DNA双链复制，图中物质A是引物，B酶是Taq酶。‎ ‎(3)将目的基因导入植物细胞有多种方法，最常用的是农杆菌转化法。‎ ‎(4)若需要对转入抗草甘磷酶的基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做喷洒草甘磷操作，以检验是否抗草甘磷。‎ ‎(5)若实验结果不理想，为了提高抗草甘磷酶的活性，可以通过蛋白质工程设计和改造编码抗草甘磷酶的基因。‎ 技法提升 生物体内DNA复制与PCR反应的区别 题组三　基因工程操作程序及实例 ‎5.(2016·海南高考)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：‎ ‎(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即________和从________中分离。‎ ‎(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是_________________________________________。‎ ‎(3)在基因表达载体中，启动子是________‎ 聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是________。‎ ‎(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有________和________颗粒。‎ 答案　(1)人工合成　生物材料 ‎(2)cDNA文库中只含有叶细胞已转录的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因 ‎(3)RNA　大肠杆菌(或答细菌)‎ ‎(4)金粉　钨粉 解析　(1)目的基因可以人工合成，也可以从自然界中已有的生物材料中分离得到。‎ ‎(2)基因组文库构建过程是将某种生物的DNA全部提取出来，用酶切成片段后将DNA片段与载体连接，导入受体菌的群体中储存，故基因组文库包含了某种生物的所有基因；cDNA文库构建过程是用某个发育时期的mRNA反转录产生的cDNA片段与载体连接后导入受体菌的群体中储存，故cDNA文库只包含某种生物的一部分基因，故cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少。‎ ‎(3)启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为受体细胞，常选用的原核生物是大肠杆菌。‎ ‎(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有钨粉颗粒和金粉颗粒。‎ ‎6．(2017·山东高三月考)内皮素(ET)是一种含21个氨基酸的多肽。内皮素主要通过与靶细胞膜上的内皮素受体结合而发挥生物学效应。ETA是内皮素的主要受体，科研人员试图通过构建表达载体，实现ETA基因在细胞中高效表达，为后期ETA的体外研究奠定基础。其过程如图(图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为C↓CCGGG，限制酶XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG)。请分析回答：‎ ‎(1)完成过程①需要的酶是________。‎ ‎(2)过程③中，限制酶XhoⅠ切割DNA，使________键断开，形成的黏性末端是________。用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是______________________________________。‎ ‎(3)过程④中需要________酶，去构建重组质粒。过程⑥中，要用________预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界的DNA的状态。‎ ‎(4)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是__________________________。‎ ‎(5)人皮肤黑色素细胞上有内皮素的特异受体，内皮素与黑色素细胞膜上的受体结合后，会刺激黑色素细胞的分化、增殖并激活酪氨酸酶的活性，从而使黑色素急剧增加。美容时可以利用注射ETA达到美白祛斑效果，试解释原因：______________________________抑制了内皮素使黑色素细胞增殖和使黑色素增加的作用。‎ 答案　(1)逆转录酶 ‎(2)磷酸二酯　　可以使目的基因定向连接到载体上 ‎(3)DNA连接　Ca2＋(或CaCl2)‎ ‎(4)检测ETA基因能否表达及表达量 ‎(5)ETA 能与内皮素结合，减少了内皮素与黑色素细胞膜上内皮素受体的结合 解析　(1)图中①过程是逆转录过程，需要逆转录酶的催化。‎ ‎(2)过程③利用限制酶XhoⅠ切割DNA获得目的基因的过程，限制酶使得DNA的磷酸二酯键断开，形成的黏性末端是。图中显示利用了两种限制酶切割目的基因和载体，从而获得了不同的黏性末端，可以使目的基因定向连接到载体上。‎ ‎(3)基因表达载体构建中，需要用DNA连接酶连接目的基因和质粒。过程⑥重组质粒导入受体细胞的过程，要用Ca2＋(或CaCl2)预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界DNA的感受态。‎ ‎(4)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，可以检测ETA基因能否表达及表达量。‎ ‎(5)ETA能与内皮素结合，减少了内皮素与黑色素细胞膜上内皮素受体的结合，抑制了内皮素使黑色素细胞增殖和使黑色素增加的作用，从而达到美容的目的。‎ 考点3　基因工程的应用及蛋白质工程 ‎ ‎ ‎1．基因工程的应用 ‎(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。‎ ‎(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。‎ ‎(3)比较基因治疗与基因诊断 ‎2．蛋白质工程 ‎(1)概念理解 ‎①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。‎ ‎②操作：基因修饰或基因合成。‎ ‎③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。‎ ‎④目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。‎ ‎(2)操作过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。其流程图如下：‎ ‎1．深挖教材 对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？‎ 提示　毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：①‎ 任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。②对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。‎ ‎2．判断正误 ‎(1)通过转基因技术获得的抗虫棉具有永久抗虫能力(×)‎ ‎(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)‎ ‎(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)‎ ‎(4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(×)‎ ‎(5)基因治疗是指将缺陷基因诱变为正常基因，基因诊断依据的原理是DNA分子杂交(×)‎ ‎(6)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×)‎ 题组一　基因工程应用及实例 ‎1.(2018·江苏南通全真模拟)科学家利用基因工程技术将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。在培养转基因番茄的过程中，下列操作不合理的是(　　)‎ A．可用PCR技术或逆转录法获得抗冻蛋白基因 B．利用选择性培养基对构建的基因表达载体直接筛选 C．利用农杆菌转化法将基因表达载体导入番茄体细胞 D．在低温条件下筛选已导入抗冻蛋白基因的番茄植株 答案　B 解析　基因工程中获取目的基因的方法包括PCR 技术体外扩增、从基因文库中获取或人工合成(如逆转录法获得目的基因)，A正确；构建的基因表达载体不可直接在选择培养基上进行筛选，需要先导入受体细胞中再进行筛选，B错误；农杆菌转化法是目的基因导入受体细胞的常用方法，C正确；可利用低温条件对耐寒番茄进行个体性状水平的检测，筛选成功转基因的耐寒番茄植株，D正确。‎ ‎2．(2017·安徽安庆二模)α1－抗胰蛋白酶是肝脏产生的一种糖蛋白，缺乏会引起肺气肿。某公司成功研制出转基因羊，进入泌乳期后，其乳汁中含有人类的α1－抗胰蛋白酶，用于治疗肺气肿。回答下列问题：‎ ‎(1)为获取目的基因，需要在肝细胞中提取________，通过反转录产生cDNA，再通过________技术进行快速扩增。‎ ‎(2)将α1－抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的________等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，然后通过________技术，导入羊的受精卵中。‎ ‎(3)受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到________阶段，通过胚胎移植到受体子宫孕育。为选育出能泌乳的雌羊，移植前需从胚胎的________部位取样，做DNA分析鉴定性别。‎ ‎(4)α1－抗胰蛋白酶是一种结构较复杂的糖蛋白，因此用上述方法生产，相对传统的转基因大肠杆菌生产，优势在于________。‎ 答案　(1)mRNA　PCR ‎(2)启动子(或启动子、终止子)　显微注射 ‎(3)桑椹胚或囊胚　滋养层 ‎(4)羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力 解析　(1)α1－抗胰蛋白酶基因在肝细胞中表达，所以可以在肝细胞中提取mRNA，反转录产生相应cDNA，再通过PCR扩增。‎ ‎(2)为了使α1－抗胰蛋白酶基因在乳腺细胞中表达，需要将其与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组，构建基因表达载体，然后通过显微注射技术，导入受精卵中。‎ ‎(3)牛和羊的胚胎一般发育到桑椹胚或囊胚，再进行胚胎移植；‎ DNA分析鉴定性别需从胚胎的滋养层部位取样，这样既保证了遗传信息一致，又不影响内细胞团进一步发育。‎ ‎(4)糖蛋白的形成需要进行蛋白质的加工，相对原核细胞而言，羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力。‎ 题组二　蛋白质工程 ‎3.下列关于蛋白质工程的进展和应用前景的叙述中，不正确的是(　　)‎ A．通过对基因结构的定点突变实现玉米赖氨酸合成的关键酶结构的改变属于蛋白质工程 B．将人的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞内，使大肠杆菌生产人的胰岛素的技术属于蛋白质工程 C．对蛋白质进行分子设计必须从蛋白质的功能特点入手 D．通过对基因结构的改造生产出的自然界中从未存在的蛋白质种类目前还很少 答案　B 解析　蛋白质工程的实质是通过对基因结构的改造来实现对蛋白质改造的技术，A正确；将人的胰岛素基因导入大肠杆菌，生产的仍然是人的胰岛素，并没有产生自然界不存在的蛋白质，所以不属于蛋白质工程，B错误；蛋白质工程的途径是从预期的蛋白质功能出发，设计出预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的核糖核苷酸序列，然后找到相对应的脱氧核苷酸序列，C正确；通过对基因结构的改造生产出的自然界不存在的蛋白质产品较少，D正确。‎ ‎4．(2018·河南濮阳模拟)中国科研人员首次将与Fib－H基因类似的人工丝蛋白基因，导入到被敲除Fib－H基因的蚕卵体内，意味着对蚕卵的基因改造获得成功。当它们长大后，吐出的丝中就含有人工合成丝蛋白。通过这种技术还可以让家蚕在吐丝的同时，按照实际需要吐出其他蛋白。含有人工合成丝蛋白的蚕茧，能发出绿色荧光，比正常的蚕茧更加轻薄。请回答下列问题：‎ ‎(1)获得人工合成蚕蛋白是通过________工程，对________‎ 进行改造，最终合成人工丝蛋白，以满足人类生产和生活的需求。与基因工程相比较，蛋白质工程产物具备的特点是______________________。基因敲除是一种特殊的基因重组技术，即将外源目的基因导入细胞从而干扰该细胞内某一基因的功能。将目的基因导入家蚕卵细胞的方法是________，此处蚕卵是指蚕的________。‎ ‎(2)将人工丝蛋白基因导入蚕卵体内之前，需要进行的核心步骤是____________，其目的是使该基因在蚕卵中__________________，并且可以遗传给下一代，同时，使其能够表达和发挥作用。‎ ‎(3)绿色荧光蛋白基因可以作为________，用于鉴别和筛选蚕卵中是否含有人工丝蛋白基因。‎ 答案　(1)蛋白质　蚕丝蛋白基因　可以生产自然界不存在的蛋白质　显微注射法　受精卵 ‎(2)构建基因表达载体　稳定存在 ‎(3)标记基因 解析　(1)蛋白质工程的概念：“指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求”。将目的基因导入动物细胞常用的方法——显微注射法，受体细胞为受精卵。‎ ‎(2)基因工程的核心步骤即构建基因表达载体，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。‎ ‎(3)绿色荧光蛋白基因可以作为标记基因，用于鉴别和筛选蚕卵中是否含有人工丝蛋白基因。‎ 技法提升 蛋白质工程与基因工程的比较 ‎(2)联系 ‎①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。‎ ‎②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。‎ 实验16　DNA的粗提取与鉴定 ‎ ‎ ‎1．DNA粗提取和鉴定的原理 ‎(1)提取思路：利用DNA和其他物质在理化性质方面的差异，提取DNA。‎ ‎(2)DNA的性质：(提取和鉴定原理)‎ ‎①DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同 ‎②DNA不溶于酒精；‎ ‎③对酶、高温和洗涤剂的耐受性强；‎ ‎④DNA＋二苯胺试剂蓝色。‎ ‎2．DNA粗提取和鉴定的操作流程 ‎1．(2017·扬州江都中学段考)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)‎ A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水 B．向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了释放出DNA C．向浓盐溶液中加蒸馏水是为了析出DNA D．用菜花替代鸡血做实验，其实验操作步骤相同 答案　D 解析　DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了让鸡血细胞吸水胀破，从而释放出DNA，B正确；向溶解DNA的浓盐溶液中加蒸馏水是为了降低DNA的溶解度，进而析出DNA，C正确；用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤不完全相同，如植物细胞有细胞壁，破碎细胞时需要研磨并加入食盐和洗涤剂，D错误。‎ ‎2．下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验依据原理的叙述，错误的是(　　)‎ A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白质能溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离 B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离 C．利用二苯胺与DNA沸水浴呈现蓝色可用于DNA的鉴定 D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离 答案　B 解析　高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在60～80 ℃发生变性，而DNA在‎80 ℃‎以上才变性。‎ 技法提升 DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、‎‎4”‎ 高考热点突破 ‎ 1．(2017·北京高考)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。‎ 下列操作与实验目的不符的是(　　)‎ A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上 答案　C 解析　C基因两端有EcoRⅠ酶切位点，可用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒，A正确；一般用农杆菌等作为媒介去侵染植物的愈伤组织等，将含有目的基因的质粒导入细胞，B正确；据图可知，质粒中含有潮霉素抗性基因，不含卡那霉素抗性基因，故无法用卡那霉素来筛选被转化的菊花细胞，C错误；检测C基因是否整合到菊花染色体上，常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作为标记，以此作为探针，使探针与C基因杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中，D正确。‎ ‎2．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：‎ ‎(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为 受体细胞却未得到蛋白A，其原因是___________________________。‎ ‎(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是______________。‎ ‎(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。‎ ‎(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是___________________________________________________。‎ 答案　(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A ‎(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 ‎(3)繁殖快、容易培养 ‎(4)蛋白A的抗体 ‎(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体 解析　(1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。‎ ‎(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。‎ ‎(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。‎ ‎(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原—抗体杂交法。‎ ‎(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R 型细菌的DNA分子中并成功表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。‎ ‎3．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：‎ ‎(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_______________________________________。‎ ‎(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是____________。‎ ‎(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________(答出两点即可)。‎ ‎(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________________。‎ ‎(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________________________________。‎ 答案　(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解 ‎(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA ‎(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 ‎(4)磷酸二酯键 ‎(5)目的基因的转录或翻译异常 解析　(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。‎ ‎(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作 用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。‎ ‎(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。‎ ‎(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。‎ ‎(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。‎ ‎4．(2017·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_______________________________________________________。‎ ‎(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为______________，加入了____________________作为合成DNA的原料。‎ ‎(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。‎ ‎①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的 CO2浓度，CO2的作用是______________________。‎ ‎②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。‎ 答案　(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子 ‎(2)模板　dNTP ‎(3)①进行细胞传代培养　维持培养液的pH　②C ‎ 解析　(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则基因表达载体中编码乙的DNA序列起始端无ATG，无论以DNA的哪条链为模板，转录出的mRNA都无起始密码子AUG，使所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。‎ ‎(2)在PCR技术中，除了引物和耐高温的DNA聚合酶外，还需要序列甲(DNA片段)作为模板，dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)作为原料。‎ ‎(3)①当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，可能是由于发生了接触抑制，可用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，制成细胞悬液分瓶继续传代培养。动物细胞培养中，CO2的作用是维持培养液的pH。‎ ‎②对照分析图1和图2可知，能刺激T淋巴细胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而对T淋巴细胞增殖促进作用很弱的丙中没有C片段，据此可知，若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。‎ ‎5．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：‎ ‎(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。‎ ‎(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________，而造成引物自连。‎ ‎(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。‎ ‎(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。‎ ‎(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。‎ 答案　(1)逆转录　cDNA ‎(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对 ‎(3)变性 ‎(4)引物与模板　G、C含量高 ‎(5)②③‎ 解析　(1)目的基因的获取：从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR的扩增。‎ ‎(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物 ‎2)，为方便基因与运载体相连构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。‎ ‎(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。‎ ‎(4)退火温度过高，会破坏引物与模板的碱基配对。因A、T之间形成两个氢键，G、C之间形成三个氢键，形成G、C碱基对需要更多的能量，故需要更高的温度。‎ ‎(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板结合。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。‎ ‎6．(2017·天津高考节选)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需进行试验。‎ 获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。‎ ‎(1)为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是________(单选)。‎ ‎①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点 ‎②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点 ‎③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同 ‎④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同 A．①③ B．①④ C．②③ D．②④‎ ‎(2)下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知，细胞脱分化时使用的激素是________，自交系________的幼胚 最适合培养成愈伤组织作为转化受体。‎ ‎(3)农杆菌转化愈伤组织时，TDNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织，需使用含________的选择培养基。‎ ‎(4)转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织，出现蓝色的是________(多选)。‎ A．无农杆菌附着的未转化愈伤组织 B．无农杆菌附着的转化愈伤组织 C．农杆菌附着的未转化愈伤组织 D．农杆菌附着的转化愈伤组织 ‎(5)组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交，在子代含G基因的植株中，纯合子占________。继续筛选，最终选育出抗除草剂纯合自交系A。‎ 答案　(1)A　(2)2,4D　乙　(3)除草剂　(4)BD　(5) 解析　(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载体)发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点，含目的基因的DNA 片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。‎ ‎(2)细胞脱分化形成愈伤组织。表格信息显示，使用了2,4D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚，不仅要易脱分化，而且还要易再分化生芽、生根，故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。‎ ‎(3)构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于TDNA片段上)，因利用农杆菌转化法转基因时，只有TDNA整合到植物细胞染色体DNA上，故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。‎ ‎(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达”，只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织，用K处理后出现蓝色，故选B、D。‎ ‎(5)转基因植株相当于携带G基因的杂合子，转基因植株自交，后代有3/4植株携带G基因，其中纯合子占1/3。‎ 限时规范特训 ‎1．(2017·漳州三模)科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制性核酸内切酶切割位点，如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图(ampt为抗氨苄青霉素基因)，其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：‎ ‎(1)在构建重组DNA时，可用一种或多种限制性核酸内切酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性核酸内切酶________________分别对________、________进行切割，切割后产生的DNA片段分别为________、________种。‎ ‎(2)培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使Ⅰ重组DNA中含有________________作为标记基因。‎ ‎(3)研究人员通常采用________________法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。‎ 答案　(1)PstⅠ、SmaⅠ　含鱼抗冻蛋白基因的DNA　质粒　4　2‎ ‎(2)抗氨苄青霉素基因　(3)农杆菌转化 解析　(1)在构建基因表达载体时，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段，而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段。‎ ‎(2)能在含氨苄青霉素的培养基中生长的细胞具有抗氨苄青霉素基因，故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因。‎ ‎(3)将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法。‎ ‎2．(2017·东北三省三校一模)马铃薯是重要的经济作物，在基因育种方面取得丰硕成果。‎ ‎(1)马铃薯是双子叶植物，常用______________法将目的基因导入马铃薯受体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有目的基因、__________、__________、__________、复制原点五部分。‎ ‎(2)马铃薯易患多种疾病，导致产量下降。基因工程中常用的抗病基因为__________________(写一种即可)。‎ ‎(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，主要从两个方面进设计：‎ ‎①修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂__________________，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。‎ ‎②引入酶或酶系统，使除草剂在发生作用前_______________________________________________________。‎ ‎(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行________________。‎ 答案　(1)农杆菌转化　启动子　终止子　标记基因 ‎(2)病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、抗毒素合成基因、几丁质酶基因(任答一种即可)‎ ‎(3)①不敏感(抵抗)　②被降解(分解)‎ ‎(4)检测和鉴定 解析　(1)马铃薯是双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入双子叶植物体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点五部分。‎ ‎(2)基因工程中常用的抗病基因为病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、抗毒素合成基因、几丁质酶基因。‎ ‎(3)①除草剂只能作用于杂草，不能作用于转基因马铃薯，因此需要修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感(抵抗)，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。②也可以引入酶或酶系统，使除草剂在发生作用前被降解(分解)。‎ ‎(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行检测和鉴定。‎ ‎3．(2017·吉林长春二模)如图表示科学家培育耐寒生物的过程，请回答：‎ ‎(1)从cDNA文库中获取的目的基因________(有/无)启动子。实 现①过程常用________技术，该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成________。‎ ‎(2)②表示________________，其中标记基因的作用是__________________________。‎ ‎(3)转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是用DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体上的DNA是否插入目的基因，这种方法需要遵循__________________原则。‎ ‎(4)若要培育抗冻能力强的转基因羊，可将鱼的抗冻蛋白基因导入羊的________中，培育该转基因羊的最后一道“工序”是胚胎工程的________________技术。‎ 答案　(1)无　PCR　引物 ‎(2)基因表达载体　鉴别受体细胞中是否含有目的基因 ‎(3)碱基互补配对 ‎(4)受精卵　胚胎移植 解析　(1)用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫这种生物的cDNA文库，由于启动子不能转录，因此cDNA文库中没有基因的启动子；PCR技术可在体外大量扩增目的基因，该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。‎ ‎(2)②表示基因表达载体，其中标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因。‎ ‎(3)DNA分子杂交技术遵循碱基互补配对原则。‎ ‎(4)培育转基因动物时，常以受精卵作为受体细胞，因为受精卵的全能性最高，培育该转基因动物的最后一道“工序”是胚胎移植。‎ ‎4．(2017·河北唐山期末)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：‎ ‎(1)PCR过程所依据的原理是________________，利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根 据这一序列合成________；扩增过程需要加入_________________酶。‎ ‎(2)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是____________________________。目的基因能在不同生物体内正常表达，说明整个生物界______________。PCR定点突变技术属于________的范畴。‎ ‎(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体。常用________将基因表达载体导入植物细胞，还需用到植物细胞工程中的________技术，来最终获得转基因植物。答案　(1)DNA双链复制　引物　耐高温的DNA聚合(或Taq)‎ ‎(2)RNA聚合酶识别和结合部位，可驱动基因转录出mRNA　共用一套密码子　蛋白质工程 ‎(3)农杆菌转化法　植物组织培养 解析　(1)PCR依据的原理是DNA双链复制，在用PCR技术扩增目的基因前要依据一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列合成引物；扩增过程需要加入耐高温的DNA聚合(或Taq)酶。‎ ‎(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，可驱动基因转录出mRNA；因生物界共用一套遗传密码，所以目的基因可以在不同细胞内表达。‎ ‎(3)常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞，借助于植物组织培养技术，获得转基因植物。‎ ‎5．(2017·湖南衡阳一模)基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”的构建过程如下：‎ 第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞(ES)，在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。‎ 第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因(同源臂)，在同源臂上接入neoR(新霉素抵抗基因)等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样，将表达载体准确地带到靶基因的位置。第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。‎ 第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。基本原理如图所示：‎ 请根据上述资料，回答下列问题：‎ ‎(1)实施基因工程的核心步骤是__________________，基因表达载体中的________是位于基因首端的有特殊结构的DNA片段；在构建的过程中所需要的工具酶是________________________。‎ ‎(2)如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是________，原因是_____________________________________。‎ ‎(3)上述资料中neoR基因的作用最可能是________________________。为了鉴定目的基因是否成功表达，有时进行抗原—抗体杂交，目的蛋白相当于________。‎ ‎(4)该项技术具有广阔的应用前景，请试举一例：_________。‎ 答案　(1)基因表达载体的构建　启动子　限制性核酸内切酶和DNA连接酶 ‎(2)受精卵　动物受精卵具有全能性(动物不能像植物那样，利用一个除受精卵以外的独立的体细胞直接培养成完整的个体)‎ ‎(3)作为标记基因，便于筛选　抗原 ‎(4)基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等 解析　(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。基因表达载体中的启动子是位于基因首端的有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点，能启动转录过程；在构建基因表达载体时，首先要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，其次需要用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。‎ ‎(2)受精卵的全能性最高，因此要获得一只含目的基因的小鼠，‎ 常选择受精卵作为受体细胞。‎ ‎(3)上述资料中，neoR基因(新霉素抵抗基因)可作为标记基因，便于筛选。为了鉴定目的基因是否成功表达，有时进行抗原—抗体杂交，目的蛋白相当于抗原。‎ ‎(4)该项技术具有广阔的应用前景，可用于基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等。‎ ‎6．(2017·榆林一模)材料一：人类可利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物“偏爱”的密码子来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在胰岛素COOH端加上KDEL内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。将该基因置于果实专一性启动子的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。‎ 材料二：T4溶菌酶在温度较高时易失去活性，科学家对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使其表达的T4溶菌酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。‎ ‎(1)材料一中基因工程操作是采用________方法获得目的基因的。获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因中编码氨基酸的碱基序列不同，但两者所编码的蛋白质中氨基酸序列相同，这是因为密码子具有________。要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用________技术。‎ ‎(2)根据上述描述，转基因操作时所用的载体是______________，载体上的________可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。‎ ‎(3)材料二属于__________工程范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对________进行改造，或制造一种________的技术。‎ 答案　(1)人工合成　简并性　PCR ‎(2)农杆菌的Ti质粒　TDNA ‎(3)蛋白质　现有蛋白质　新蛋白质 解析　(1)根据题干信息可知材料一中基因工程操作是采用人工合成的方法获得目的基因的。虽然获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因中编码氨基酸的碱基序列不同，但所编码的蛋白质的氨基酸序列却相同，是由于密码子具有简并性，目的基因可以采用PCR技术扩增产生大量的目的基因。‎ ‎(2)根据“将该基因置于果实专一性启动子的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中”可知该过程的载体是农杆菌的Ti质粒，质粒上的TDNA可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。‎ ‎(3)材料二中的技术属于蛋白质工程的范畴，该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质的技术。‎ ‎7．(2018·河北衡水中学月考)请回答利用农杆菌转化法培育转基因植物的相关问题：‎ ‎(1)培育转基因植物过程的核心步骤是________，其目的是使目的基因在受体细胞中________，并且可以通过复制遗传给下一代，同时，使目的基因表达和发挥作用。‎ ‎(2)构建基因表达载体时，可利用DNA连接酶连接被限制酶切开的________键。基因表达载体的组成部分包括启动子、终止子、目的基因、________、复制原点等。‎ ‎(3)组成基因表达载体的单位是________。基因表达载体中的启动子是________识别和结合的部位，这种结合完成后才能驱动目的基因通过________(填过程)合成mRNA。‎ ‎(4)用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，应选用的Ti质粒是如图中的________。‎ 注：图中箭头所指的位置是限制酶识别和切割的位点。‎ 答案　(1)基因表达载体的构建　稳定存在 ‎(2)磷酸二酯　标记基因 ‎(3)脱氧核苷酸　RNA聚合酶　转录　(4)甲 解析　(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以通过复制遗传给下一代，同时使目的基因表达和发挥作用。‎ ‎(2)DNA连接酶的作用是在DNA片段之间形成磷酸二酯键。基因表达载体的组成包括启动子、目的基因、标记基因和终止子等。‎ ‎(3)基因表达载体的本质是DNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸；基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，这种结合完成后才能驱动目的基因通过转录合成mRNA。‎ ‎(4)用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。甲Ti质粒中含有限制酶XbaⅠ和SacⅠ的切割位点，且用这两种酶切割可将目的基因插入TDNA中，甲正确。‎ ‎8．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。‎ ‎(1)图中实验材料A可以是________等，研磨前加入的B应该是________。‎ ‎(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol/L ‎ 的NaCl溶液的目的是________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是____________________________________________。‎ ‎(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。‎ ‎(4)DNA鉴定的原理是_________________________________。‎ 答案　(1)洋葱(菜花等)　洗涤剂和食盐 ‎(2)使DNA溶解　使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 ‎(3)H ‎(4)在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色 解析　选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨。DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小，向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。向滤液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质；DNA不溶于冷酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA；鉴定DNA的原理是在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。‎