【生物】2020届一轮复习人教版基因表达载体构建中限制酶选择原则学案

【生物】2020届一轮复习人教版基因表达载体构建中限制酶选择原则学案

‎2020届 一轮复习 人教版 基因表达载体构建中限制酶选择原则 学案 限制酶选择的三大依据 ‎1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 图1‎ ‎(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。‎ ‎(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。‎ ‎(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。‎ ‎2.根据质粒的特点确定限制酶的种类 ‎(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。‎ ‎(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。‎ ‎(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。‎ ‎(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而Nde Ⅰ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。‎ ‎3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。(分析如下)‎ ‎1.(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接，理由是________________________________________________________‎ ‎_____________________________________________________________________。‎ ‎(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图(c)所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　，不能表达的原因是_______________________________‎ ‎____________________________________________________________________。‎ 图(c)‎ ‎(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有　　　　和　　　　，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_______________________________。‎ ‎[慧眼识图　获取信息]‎ ‎(1)三种限制酶切割结果分析 ‎(2)基因表达载体分析 答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)‎ 甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶 ‎2.(2016·经典高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：‎ ‎(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用　　　　两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过　　　　酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于　　　　态的大肠杆菌。‎ ‎(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加　　　　，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中　　　　。‎ ‎(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为　　　　，对于该部位，这两种酶　　　　(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。‎ ‎(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得　　　　种大小不同的DNA片段。‎ 审题指导 第一步：首先看目的基因两侧有何种切割位点以保障能将目的基因“切出”‎ 如图2使用BamHⅠ、BclⅠ可切断左侧，HindⅢ、Sau3AⅠ可切断右侧 第二步：再回到“质粒”，看质粒中限制酶切割位点，如图中总共有BamHⅠ、BclⅠ、BamHⅠ及HindⅢ四个限制酶识别位点，其中并不存在目的基因中Sau3A Ⅰ酶识别位点，故不选Sau3A Ⅰ酶，而BamHⅠ 在四环素抗性基因与氨苄青霉素抗性基因中均存在，倘若使用该酶将会导致两个标记基因同时被破坏，故只能选择BclⅠ与HindⅢ，而使用此两类酶将导致氨苄青霉素抗性基因遭破坏，因此制备重组质粒选择培养基时只能依据“四环素抗性基因”，如下图所示：‎ 此外，根据BamHⅠ和BclⅠ的酶切位点，BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ‎，这与两种酶的酶切位点均不同，即两种酶在该片段找不到识别位点。又根据BamHⅠ、BclⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。‎ 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA连接　感受　(2)四环素　引物甲和引物丙　(3)　都不能　(4)7‎ ‎1.(2019·河南中原名校联考)人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性“乙型肝炎疫苗”是取用乙肝病毒感染者的血液，用差速离心提纯血液中的乙肝病毒，之后再灭活，制成乙肝疫苗。基因工程乙肝疫苗的生产和使用过程如图1，图2示意大肠杆菌质粒的相关基因与限制酶切点；图3示意有关限制酶在DNA分子中的具体切点。请回答相关问题：‎ ‎(1)从图1可知，该目的基因的具体功能是_________________________________。‎ ‎(2)选择大肠杆菌质粒作为运载体的原因是________________________________‎ ‎____________________________________________________________________。‎ ‎(3)用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因：___________________________________________________________________________________________________________________________________________。‎ ‎(4)形成有效的重组质粒，选择适当的限制性内切酶很重要。某学习小组根据图2和图3提出了三种方案：单独使用BamH Ⅰ、分别使用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ以及分别使用HindⅢ和EcoR Ⅰ，且认为选择使用BamHⅠ和EcoRⅠ最佳。该方案的优点是______________________________________________________________。‎ 如果选择使用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ，则在构建重组质粒后，还需要运用　　　　技术以检测目的基因是否导入受体细胞。‎ 答案　(1)指导合成乙肝病毒外壳 ‎(2)①对受体细胞无害；②具标记基因，能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴定；③在宿主细胞内能自我复制；④具有多个酶切位点，供外源基因插入其中。‎ ‎(3)血源性疫苗需灭活破坏其核酸结构，灭活不成功则会导致接种者患乙肝，而基因工程疫苗仅有乙肝病毒外壳，不需要灭活 ‎(4)既防止了质粒发生自身环化和目的基因与质粒之间的反向连接，又便于筛选出含有目的基因(重组质粒)的受体细胞　DNA分子杂交(或核酸分子杂交、分子杂交)‎ ‎2.(2019·山东湖北部分重点中学联考)如图所示为培育二倍体转基因抗虫玉米的两种思路。EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ为限制酶(箭头所指为酶切位点)。回答下列问题：‎ ‎(1)据图，获取目的基因时不能选择SmaⅠ酶的原因是它_____________________。‎ 选择EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶的优点是可避免目的基因与质粒　　　　连接。‎ ‎(2)与思路1相比，思路2的最大优点是获得的转基因抗虫玉米　　　　。‎ ‎(3)培育转基因抗虫玉米的核心步骤是___________________________________。‎ 其目的是使目的基因在受体细胞中______________________________________。‎ ‎(4)将重组质粒导入受精卵，采用最多的方法是农杆菌转化法，这跟农杆菌的　　　　有关。‎ ‎(5)操作⑤常用的方法是________________________________________________。‎ 解析　(1)题图显示：目的基因中存在Sma Ⅰ的识别位点。若使用Sma Ⅰ切割外源DNA，则会破坏外源DNA中的目的基因的结构，因此获取目的基因时不能选择Sma Ⅰ切割。EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别位点不同，形成的黏性末端不同，因此选择EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒和外源DNA，其优点是可避免目的基因与质粒反向连接。‎ ‎(2)思路1是将重组质粒导入玉米的受精卵中，由该受精卵发育成的植株不一定都是纯合子，思路2是将重组质粒导入由花粉经过脱分化形成的愈伤组织中，由该愈伤组织形成的单倍体幼苗2再经过人工诱导，使其染色体加倍，最终得到的玉米株都是纯合子。可见，与思路1相比，思路2的最大优点是获得的转基因抗虫玉米都是纯合子(或答不发生性状分离)。‎ ‎(3)培育转基因抗虫玉米采用的是基因工程技术，该技术的核心步骤是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的是：使目的基因在受体细胞中稳定存在并可遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。‎ ‎(4)农杆菌的Ti质粒上具有T－DNA，T－DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。在培育转基因植物时，采用最多的方法是农杆菌转化法，正是利用了农杆菌的Ti质粒上具有的T—DNA的这一特点。操作⑤是人工诱导染色体数目加倍，常用的方法是用秋水仙素处理幼苗。‎ 答案　(1)破坏目的基因的结构　反向　(2)都是纯合子(或答不发生性状分离)　(3)‎ 基因表达载体的构建　稳定存在并可遗传给下一代同时使目的基因能够表达　(4)Ti质粒上具有T－DNA　(5)用秋水仙素处理幼苗