跑台运动对大鼠股四头肌pi3kmrna表达的影响

跑台运动对大鼠股四头肌pi3kmrna表达的影响

分类号G804.7陕西师范大学学士学位论文跑台运动对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达的影响作者单位体育学院指导老师唐量作者姓名田博专业、班级体育教育2009级5班提交时间二○一三年五月\n跑台运动对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达的影响田博（陕西师范大学体育学院，陕西西安710062）摘要：探讨中等强度耐力训练对股四头肌PI3KmRNA基因和蛋白表达的影响。方法：18只健康的SD大鼠随机分为安静组、有氧运动组和负重跑台训练组，每组6只。训练组采用跑台训练方案,训练8周后两组大鼠安静状态下处死，取股四头肌。采用ReverseTranscription-PCR方法测定大鼠股四头肌PI3K基因的mRNA的表达。结果:8周运动训练后大鼠股四头肌PI3KmRNA的表达量比安静组的显著增多；而负重组比有氧运动组PI3KmRNA的表达量显著增加。关键词:磷酯酰肌醇3-激酶;股四头肌;抗阻力运动；PCR中图分类号：G804.7文献识码：ATheImpactofTreadmillExerciseOnRatQuadricepsPI3KmRNAExpressionTIANBo（InstituteofphysicalEducation,shaanxiNormalUniversityxi’an710062Shaanxi）Abstract:Toinvestigatetheimpactofmoderate-intensityendurancetrainingonthequadricepsfemorisPI3KmRNAgeneandproteinexpression，herearethemethods.Atfirst，18healthySDratswererandomlydividedintothreegroups:thequietgroup，theaerobicexercisegroupandtheresistancetraininggroup，andeachgrouphad6rats.Traininggroupadoptedtreadmillexercise.Theyweretrainedfor8weeksbeforetheywerekilledinquietcondition.ThenwepickeduptheirquadricepsmuscleanduseReverseTranscription-polymerasechainreaction(PCR)todeterminethemRNAexpressionofrats’quadricepsPI3Kgene.Asaresult，after8weeks，trainingratshadmorequadricepsPI3KmRNAexpressionthanquietgroupsignificantly.Atthesametime，thenegativerecombinantalsohadmorePI3KmRNAexpressionthanaerobicexercisegroup.Keywords:phosphoinositide3-kinase;quadricepsfemoris;resistedmovement;PCR1前言近几十年来，大鼠抗阻训练在研究力量训练的生物学适应机制中被国际上较为广泛采用。众多学者从多角度切入对抗阻力训练的生理适应机制展开了广泛的探索与研究，其中涉及骨骼、肌肉、心血管及内分泌系统适应性变化[1]。抗阻力训练又称阻力运动或力量运动，是一种无氧运动，主要包括负重抗阻运动、对抗性运动、克服弹性物体运动和利用力量训练器械等[2]。\n抗阻力运动对骨骼肌的影响表现在骨骼肌细胞内的收缩成分、肌糖原、肌红蛋白增多，线粒体体积、数量增加，以及毛细血管分布在骨骼肌上的密度加大等，使骨骼肌的有氧代谢能力加强，肌肉收缩效率提高，运动到力竭的时间延长。抗阻力运动的主要目的是锻炼肌肉，能明显增加肌肉体积、力量和耐力等，可使肌肉GLUT4和胰岛素受体总量增加，从而增加肌肉葡萄糖的储存和利用。研究表明，PI3K是多个信号转导通路的关键蛋白，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，PI3K活性的增加常与多种癌症相关。研究发现PI3k/Akt信号途径是调节胰岛素和多种主要信号途径之一[3]，在骨骼肌PI3K/Akt信号转导网络中，任何一个激酶的表达和活性的改变都会导致胰岛素生物活性的降低。运动可促使PI3K和磷酸化PI3K活化，PI3K活化后，使磷脂酞肌醇(PI)、磷脂酞肌醇一磷酸(PIP)和磷脂酞肌醇二磷酸(PIP2)磷酸成PIP、PIP2和磷脂酞肌醇三磷酸(PIP3)，与PH段的下游分子结合，将信号向下传导，下游信号分子蛋白激酶B（Akt）在在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶(PDK)的协同作用下，导致Akt从胞浆转位到质膜，并促进Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化而激活，激活后的Akt通过促进下游底物磷酸化而发挥广泛的生物效应[4]。近年来的相关研究成果已经初步揭示了有氧运动所引起的骨骼肌蛋白质合成变化过程中细胞信号转导的网络工作互动，这种运动性细胞信号转导的网络工作互动，既可以是正性联络也可以是负性联络。但是有关研究抗阻力运动对骨骼肌影响的文献尚未发现，本课题针对抗阻力运动对骨骼肌PI3KmRNA表达量的影响进行研究。深入地探索这种多途径细胞信号网络转导过程对理解运动训练适应的细胞分子机制，提供了重要的理论依据。2材料与方法2.1实验动物与分组取健康SD大鼠18只，平均体重500克，均为清洁级，从第四军医大学购买。购回后在陕西师范大学体育学院实验室内进行分笼饲养，室温控制在22℃±2℃，相对湿度45%～55%，每天自然光照，自由饮水摄食，用高脂饲料喂养,饲养笼垫料使用高压灭菌消毒垫料，每周更换2次。大鼠购回后适应性饲养一周，称量体重，随机分为3组，每组6只，组间动物的体重无显著性差异(表1)。表1本研究实验动物分组情况一览表(只)组别正常对照组有氧运动组负重跑台组GroupNCAEMRTN666\n2.2训练方案先无负重适应性训练1周，所有运动组大鼠参加，在跑台上进行跑速为10m/min，每天30min的适应性训练。再负重适应性训练1周，所有运动组大鼠参加，在跑台上进行跑速为10m/min，每天30min的负重适应性训练，跑台坡度设置为0°。负重形式采用在大鼠的腰背部绑缚条形负荷，负重量为其最大负重的10%[5]。负重组所有大鼠在跑台上进行为期8周的正式负重跑训练，中等强度腹背部负重，负重量为最大负重的50%（图1）。跑台设置为跑速15m/min，坡度0°，以跑2min，休息2min为1组，共训练10组，每日1次，周日休息，共训练8周；有氧运动组，跑台设置为跑速15m/min，坡度0°，每次训练40min，一周六天，周日不做，训练8周；安静对照组的所有大鼠，令其正常饮水摄食，不施加任何运动干预[6]。图1施加负荷方式图2.3动物取材在正式负重跑训练的第8周后，所有大鼠禁食、禁水12h，称量体重后进行取材。对各鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉，剂量为50mg/kg体重，待翻正反射消失后，解剖大鼠，迅速提取大鼠股四头肌，去除脂肪，在生理盐水中漂洗，用滤纸吸干表面水分，液氮冻干后，放入-80℃冰箱保存，待测各项指标[7]。2.4大鼠股四头肌中PI3KmRNA的检测2.4.1RT-PCR分析引物设计与合成采用Primer5.0引物设计软件，引物序列见表2，由上海康成生物有限公司合成。\n表2用于反转录PCR的引物序列及相关参数基因名双向引物序列5’-3’退火温度/℃产物长度/bpF15′AGTGGGAACCGAAGAAGAAG3’56.2384bpPI3KR25′GACGGGAACTGACTGGATGAAC3’F15’CGACTGTTAGAACTCCCTCA3’GAPDHR25’CATTGGGGGTAGGAACAC3’55.1292bp(1)总RNA提取实验器具的处理与准备：吸头、EP管等浸泡于1‰DEPC水中，37℃中浸泡8小时，然后送至高压1次。研钵、玻璃器皿、金属器皿等，冲洗干净后，用锡纸包裹180℃烘箱中烘烤8小时以上。取约50-100mg鼠股四头肌放于研钵内，用研杵研磨组织，其间不断加入液氯，直到研磨成粉末状，向研钵中加入1mLTrizol溶解，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置直至融化，在用研杵继续研磨至裂解液呈透明状，将匀浆液移至离心管中，室温静置五分钟，然后12000g4℃离心5分钟后，小心吸取上清液，移入新的离心管中。向匀浆裂解液中加入氯仿（Trizol的1/5体积），盖紧离心管盖，用手剧烈的震荡15秒，待溶解液充分融化后，再室温静置5分钟，然后12000g4℃离心15分钟后，从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至新的离心管，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分摇匀后，在20℃左右静至10分钟，再12000g4℃离心10分钟。然后在小心弃去上清液，缓慢的沿离心管壁加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠覆洗涤离心管壁，12000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇，然后室温干燥沉淀5分钟。加入适量的Trizol水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。（2）cDNA的合成建立20ul的反应体系可以用于逆转录1ng~5ug总RNA，先将1uloligo(dT)12-18（500ug/ml）加入无核酸酶的微量离心管中，再将1ul-5ul总RNA加入无核酸酶的微量离心管中，最后将1ul10mMdNTP混合物加入灭菌蒸馏水至12ul加入无核酸酶的微量离心管中。混合物在65℃加热5分钟后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后，分别加入4ul5×第一链合成缓冲液中、2ul0.1MDTT中和1ulRNaseOUT核酸酶抑制剂（40单位/ul）中。然后\n轻轻混匀离心管中各组份，37℃下孵育2分钟。再加入1ulM-MLV逆转录酶，轻轻的吹打混匀，37℃孵育50分钟，再70℃加热15分钟后终止反应。cDNA产物可以直接作为PCR的模板。（3）PCR扩增在PCR反应管中加入5ul10×PCR缓冲液、1.5ul50mMMgcl2、1ul10mMdNTP混合物、1ul上游扩增引物（10uM）、1ul下游扩增引物（10uM）、0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul）、2ulcDNA、38.1ul灭菌蒸馏水至终体积50ul的反应管中。在94℃加热2分钟变性，Pi3k退火56℃，GAPDH退火55℃，进行35个PCR循环，72℃延伸10分钟。（4）PCR产物分析电泳步骤：50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB5ul。另外450mlTAE倒入电泳槽中。用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。加样：PCRMarker：1ulMarker＋1ulLoadingBuffer＋4ulTAE混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul样品DNA＋1ulLoadingBuffer混匀后依次加入孔中。接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。电泳约1小时后，紫外灯检测。2.5统计学处理用Quantityone4.6.2软件进行图像分析，取PI3KmRNA和GAPDHmRNA的电泳结果进行吸光度分析,对产物进行相对定量。实验结果以均数士标准差表示，应用SPSS统计软件包对两组之间进行组间t检验。3结果3.1运动对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达的影响表3运动训练对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达的影响(n=6)组别正常对照有氧运动负重（中强度）NCAEMRT股四头肌1.3±0.41.2±0.2**1.0±0.1**#**表示与NC比较，p<0.01，差异极显著;#表示与AE比较，p<0.05，差异显著。\nMNCAEMRTMNCAEMRT图2总RNA提取电泳结果图3运动对PI3KmRNA表达的影响**表示与NC比较，P〈0.01，差异极显著;#表示与AE比较，P〈0.05，差异显著.图4.有氧运动与抗阻力运动PI3KmRNA表达量的比较图2、图3和图4显示，有氧运动组与对照组比较差异极显著（p<0.01），PI3KmRNA表达量明显升高；负重组与对照组比较差异显著（p<0.01），PI3KmRNA表达量明显升高。并且负重组比有氧运动组PI3KmRNA表达量显著升高（p<0.05）。4讨论与分析PI3K是细胞内重要的信号转导分子，可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)作为酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的主要下游分子，通过催化产生第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)并激活Akt、糖原合酶激酶-3(GSK-3)、Forkhead转录因子FoxO1、mTOR(mammalian\ntargetofrapamycin)等下游分子，将多种生长因子及细胞因子的信号传递到细胞内，从而对细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种生物过程起重要的调节作用[8]。图5PI3K/Akt信号转导通路图PI3K-Akt信号通路通过对下游分子如FoxO1和GSK3ß的活性调节，对糖异生基因及脂肪酸合成基因的表达具有重要的调控作用，同时对葡萄糖转运也具有重要的调控作用[9]。PI3K/Akt信号传导通路的阻滞是外周组织胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的最基本机制之一[10]。本研究结果显示8周运动训练后大鼠股四头肌PI3KmRNA的表达量比安静组的显著增多；负重组比有氧运动组PI3KmRNA的表达量多，从而说明抗阻力运动对大鼠股四头肌PI3KmRNA表达影响更明显。5结论本研究结果显示，跑台运动对股四头肌PI3KmRNA表达量的影响起重要的作用，而负重跑台运动对股四头肌PI3KmRNA表达量的影响比有氧运动对股四头肌PI3KmRNA表达量的影响明显。参考文献：[1]陈彩珍,卢健,丁树哲,等.运动训练对大鼠骨骼肌PI3K、PTEN和AKT基因表达的影响[J].北京体育大学学报,2012,35（4）:50-58.[2]胡敏,邹亮畴,刘承宜,等.大鼠抗阻训练模型的归类与分析[J].广州体育学院学报,2009,29(5):91-96.[3]常盛.PI3K/Akt信号通路与胰岛素抵抗的研究进展[J].中医药导报,2008,14（7）:113-116.[4]罗雪婷.有氧运动及膳食干预对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌脂质代谢的影响[D].上海体育大学,2010.\n[5]药璐,张缨,张连峰.跑台运动在动物实验研究中的应用[J].中国比较医学杂志,2010,20（6）:76-81.[6]李文惠,赵斌,闫万军.不同负荷间歇负重跑训练对老龄大鼠骨骼肌MG29蛋白的影响[J].体育科学,2010,30(9):73-81.[7]牛燕媚,苑红,刘彦辉,等.有氧运动对胰岛素抵抗小鼠骨骼肌球形脂联素及腺苷酸活化蛋白激酶的影响[J].中国运动医学杂志,2009,28(1):37-40.[8]RidkerPM,RifaiN,StampferMJ,etal.Plasmaconcentrationofinterleukin-6andtheriskoffuturemyocardialinfarctionamongapparentlyhealthymen[J].Circulation,2000,101:1767-1772.[9]曹师承.运动对大鼠骨骼PI3K/AKt/mTOR与MAPK信号转导途径的影响[D].中国医科大学,2007.[10]AthertonPJ,RennieMJ.Proteinsynthesisalowpriorityforexercisingmuscle[J].JPhysiol,2006,573(2):288-289.\n致谢　　这篇论文是在我的导师唐量老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从题目的选择到论文的最终完成，唐老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在这半年的时间中，唐量副教授不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向唐老师致以诚挚的感谢和崇高的敬意。　　在此，我还要感谢陕西师范大学运动分子生物学实验室的各位师哥和师姐，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至论文的顺利完成。特别感谢我的师哥罗凯同学，他对本课题做了不少工作，给予了我许多的帮助。尤其是在实验方面手把手的对我进行指导，直至实验的完成。　　在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们!田博2013年5月