[农学]修改后遗传学实验

[农学]修改后遗传学实验

（一）课堂讲授内容（63学时）（二）课堂实验内容（27学时）基础实验内容是：1．植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察（3学时）2．植物花粉母细胞减数分裂制片技术（3学时）3．植物根尖压片技术（3学时）4．基因的独立分配和基因互作（3学时）5．果蝇的形态鉴别和饲养管理（3学时）6．果蝇的伴性遗传分析（3学时）7．基因的连锁交换与基因定位（3学时）8．果蝇唾腺染色体的观察9．红色面包霉的分离和交换（3学时）10．遗传力的估算（3学时）（根据专业从上述实验中选15学时）研究创新型的实验内容是：1．植物染色体组型分析（3学时）2．植物多倍体的诱发和鉴定（6学时）3．理化因素对植物染色体的诱变和鉴定（6学时）4．植物DNA的提取与纯化（3学时）5．植物组织培养（6学时）（根据专业从上述实验中选12学时）实验一植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察一、实验目的观察并熟悉性母细胞在减数分裂过程中的细胞学特征，重点了解染色体在这一过程中所表现的特殊变化，为研究遗传学基本规律奠定细胞学基础。二、实验原理减数分裂是性母细胞在形成性细胞时进行的一种特殊的细胞分裂方式。它包括减数第一分裂和减数第二分裂两个连续变化的阶段。每个阶段根据细胞和染色体的变化特点分为前期、中期、后期和末期四个时期。由于减数第一分裂的前期较长，染色体变化也比较复杂，所以又将第一前期分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变（浓缩）期。在减数分裂的整个过程中，同源染色体之间要发生联会、交换、分离，非同源染色体之间要发生自由组合。通过染色体的规律性变化，使最终产生的四个子细胞内染色体数目只有母细胞的一半。既然染色体是遗传物质的载体，因此染色体在减数分裂中的行为对遗传物质的分配和重组产生了重大影响。对于性母细胞和染色体的变化特点，可以通过对供试材料进行一定的制片染色处理，在光学显微镜下进行观察。三、实验材料玉米、小麦、蚕豆等花粉母细胞减数分裂的永久制片和照片。四、实验用品显微镜、擦镜纸。五、实验方法与步骤\n利用玉米、小麦和蚕豆等花粉母细胞的减数分裂永久制片，参考减数分裂各期的照片，在显微镜下进行系统地观察，掌握各期的特点。现将减数分裂各期的主要特点简述如下：1．第一前期（1）细线期：细胞核内出现细而长的染色体，交织成一团线状物，首尾不分，无法计数。核仁和核膜清晰可见。（2）偶线期：每对同源染色体顺着它们的纵长，按相同部位，紧紧地靠在一起，称为同源染色体的“联会”或“配对”。联会在一起的一对同源染色体称为“二价体”。由于此时每条染色体已经复制，因此每个二价体都包含四条染色单体。每条染色体的两条染色单体受同一着丝粒约束，它们互称姊妹染色单体。每一个二价体不同成员的染色单体互称非姊妹染色单体。由于这一时期很短，染色体又很细长，一般难以同细线期区别，并且同源染色体联会的行为在光学显微镜下看不到。这一时期核仁和核膜仍清晰可见。（3）粗线期：染色体因进一步螺旋化而呈粗线状。染色体的个体性逐渐明显。非姊妹染色单体之间的“交换”就发生在此期，但“交换”的行为不能直接在显微镜下观察到。核仁和核膜在这一时期仍然可见。（4）双线期：染色体进一步缩短变粗，每个二价体的一对同源染色体相互排斥，并开始彼此分开。但由于非姊妹染色单体的交换，每个二价体出现了数目不定的交叉结使二价体仍能维持而不完全分开。核仁和核膜仍然可见。（5）终变期：染色体高度浓缩，交叉结端化，每个二价体只在末端相连，核仁和核膜仍然可见。此时所有二价体分散在整个核内，可以进行染色体计数，某生物有多少对染色体此时就有多少个二价体。2．第一中期：核仁和核膜的消失，标志着前期的结束，中期的开始。此时，所有二价体排列在纺锤体的赤道面上。每个二价体两条染色体的着丝点分别趋向纺锤体的不同极。如果从纺锤体的一极向赤道面观察，仍可计数染色体。由于一对同源色体两个成员的着丝点朝向细胞的哪一极完全是随机的，因此在不同性母细胞中，此期染色体的排列具有多种可能性。3．第一后期：每个二价体的两条染色体都以着丝点为先导，由纺锤丝牵引分别向细胞的两极移动。结果细胞的每一极只分到了一对同源染色体中的一条，从而使每一极分到的染色体数只有原来的一半。此时分到每一极的每条染色体的两条姊妹染色单体仍然由共同的着丝点连在一起。4．第一末期：染色体到达细胞两极后，细胞的每一极又重新形成核膜和核仁，随之胞质分裂（有的植物此时胞质不分裂），形成两个子细胞，称为“二分子”。减数第一分裂结束后，经过一个短暂的间期，很快进入减数第二分裂。5．第二前期：细胞核内又重新出现染色体。每个染色体的两条姊妹染色单体仍由同一个着丝粒连在一起，但两臂已彼此分开。6．第二中期：每个子细胞内的染色体都以自己的着丝点排列在细胞的赤道面上，染色单体的两臂自由地散开。7．第二后期：每条染色体的着丝点纵裂，两条姊妹染色单体在两极纺锤丝的牵引下，相背移向两极。8．第二末期：染色体分到两极后，细胞的每一极又重新形成核仁和核膜，然后胞质分裂。从而使原来的一个母细胞分裂成四个子细胞，每个子细胞内只含有母细胞的半数染色体。开始时四个子细胞彼此靠在一起，称为“四分子”。六、实验作业1．根据自己的观察，绘出下列各期的图象，并简述其特点。粗线期、终变期、中期I、后期I、中期Ⅱ、后期Ⅱ。2．以玉米为例说明在减数分裂过程中，染色体数目怎样从2n=20变为n=10。\n实验二植物花粉母细胞减数分裂制片技术一、实验目的进一步了解高等植物性母细胞的减数分裂过程及染色体的动态变化，重点学习和掌握制备减数分裂玻片标本的方法。二、实验原理高等植物在形成雄配子的过程中，花药内的小孢子母细胞（2n），经过减数分裂最终产生四个小孢子。每个小孢子内的染色体数目已减半为n。以后每个小孢子进一步发育为花粉粒。在适宜的时期采集植物的花蕾，经固定液杀死固定，使细胞保持活体时形态。然后进行压片染色等处理，制成减数分裂玻片标本，在显微镜下进行观察，可以看到小孢子母细胞的减数分裂过程（即染色体由双倍变为单倍体的过程），研究染色体在形态和数量上的动态变化特点。三、实验材料玉米、小麦、蚕豆、棉花等。四、实验用品显微镜、天平、解剖针、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、酒精灯、吸水纸、纱布、刀片、量筒、漏斗、滤纸、木夹、标签、火柴、带橡皮头铅笔等。五、实验药品无水乙醇、95%乙醇、重铬酸钾、浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸、二甲苯、加拿大树胶和洋红（或苏木精）。六、实验方法与步骤1．玻璃器皿的洗涤：实验所用的玻璃器皿，无论是新的还是旧的，实验前都要洗刷干净。否则会影响制片效果。一般的玻璃器皿可用去污粉、肥皂水或中性洗衣粉刷洗，然后用清水冲净、晾干。新载玻片和盖玻片可在2%的盐酸酒精（95%酒精98毫升加浓盐酸2毫升）中浸泡24小时，然后用流水冲净，浸泡在95%酒精中备用。用过的旧玻片可按下面步骤洗涤：（1）将旧玻片放在肥皂水或洗衣粉溶液中煮沸5～10分钟，然后用毛刷去掉玻片上的树胶（或将玻片直接浸泡在二甲苯中，用毛刷洗刷）。（2）将洗去树胶的玻片放入重铬酸钾洗涤液（洗涤液配制见附录一）中煮沸30分钟或浸泡数小时。（3）将洗涤液倒掉，用温水冲洗2～3次，然后放在自来水下流水中冲洗2小时。（4）用蒸馏水冲洗1～2次放入95%酒精中备用。应注意，在用洗涤液煮玻片时，玻片应竖放在容器内，切勿使玻片平贴在容器的底部，以免引起暴沸。2．取材：选取适当大小的花蕾，是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。不同植物取材时期不同。（1）玉米：在抽雄前两周左右（大喇叭口期），用手指从喇叭口处向下挤捏叶鞘，触到有松软感处，即是雄花序所在部位。在该处用刀片纵向划一切口，用镊子取出花序分枝。此时雄花序先端小穗颖长4mm左右，花药长2～3mm，每一分枝中上部小穗发育最早。（2）小麦：在旗叶挑出后，旗叶与下一叶片的叶耳距约2～3cm时取材较好。但不同品种间稍有差异。（3）棉花：棉花现蕾后即进入减数分裂时期。由于其花序分节着生，因此常按花蕾的长度取材。如陆地棉，一般当三解苞长到1cm左右，花萼与花瓣等长，整个花蕾长3～5mm时取材较好。\n（4）蚕豆：从现蕾开始，可选取1～2mm大小的花蕾或一小段花序进行固定。取材时间一般在上午9时～10时，不同材料间稍有差异。3．固定：取下的材料应立即放入固定液中杀死固定。在4～15℃条件下，一般固定时间为24小时。固定后的材料先用95%酒精漂洗至无醋酸气味，再移到70%酒精中置于冰箱内保存。常用的固定液是法氏固定液（配制方法见附录二），在使用这种固定液时应注意现配现用，固定时不要在阳光下暴晒。4．染色和压片：先将已固定的材料置于培养皿内并倒入少许保存液。用镊子摘取一个适当大小的小穗或花蕾放在吸水纸上吸掉多余的酒精，然后放在载玻片中央。用解剖针挑出2～3个花药，并立即滴醋酸洋红或醋酸铁矾苏木精染色液于花药上（染液配液制见附录二）。用解剖针将花药横向切断，并从一端向切口轻轻挤压花药，使花粉母细胞从切口处逸出。然后用镊子除尽花药壁等杂物。这是压片优劣的关键步骤之一，如不去净残渣，则不容易把分裂的细胞压平，使染色体不容易分散开，并且在制作永久片的过程中，细胞会从载玻片上大量脱落。去净残渣后，在低倍镜下进行初步镜检，如果花粉母细胞处于减数分裂时期，即可加上盖玻片。加盖玻片时，先使盖玻片的一边放在载玻片上，待染液布满整个边缘时，左手握镊子顶住盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片轻轻放下（图3）。加上盖玻片以后，如有多余染色液，可用吸水纸吸去；如染色液不能布满盖玻片，则在盖玻片一边稍加染色液，然后在酒精灯上烤片。烤片时，用手平持片子在酒精灯上方来回移动，并经常将片子放在手背上试温，以片子不烫手为宜，可反复进行多次。烤片是制片过程中的一项很重要的步骤。通过烤片可使细胞质颜色变浅，而染色体能得到充分鲜明的着色。烤片以后可在盖玻片上加一小块吸水纸，以拇指或用带橡皮头的铅笔轻压盖片。应注意不要使盖片移动。如果镜检发现染色体染色太浅，可在盖玻片周围稍加染色液再烤；如果染色太深，可从盖玻片一边滴加45%冰醋酸，在另一边用吸水纸吸，让冰醋酸从盖玻片下流过直至细胞质颜色较浅而染色体着色明显清析为止。5．制作永久片：要使片子能长期保存应用，可制成永久片。永久片的制作主要包括分片、脱水透时和封片三个步骤。首先用培养皿（内置U型玻璃管或一根短玻棒）若干套编号，配制多级脱水剂（常用脱水剂见附录二）。（1）分片：准备制成永久片，首先使其翻转让盖玻片朝下浸入第一级培养皿内分片。让载玻片的一端搭在短玻棒上，另一端和皿底接触，使盖玻片自然脱落，并标记载玻片和盖玻片原来相对应的方向和位置。（2）脱水透明：用一端劈开的去磷头火柴棒夹住盖玻片（方向不变，材料朝上），放入第二级培养皿中。而载玻片要翻转使有材料的一面朝上。然后依次逐级脱水，一般每级约1～2分钟。如用第三种脱水剂每级约20～30秒钟。为了防止在脱水过程中细胞从片上脱落，在制片时可先在盖玻片上涂一层蛋白甘油胶，在酒精灯上烘烤至冒出轻烟后，稍凉片刻盖在有材料的载玻片上。（3）封片：片子从最后一级培养皿内取出后稍凉，于载玻片上原来加盖玻片的位置中间滴一滴完整的加拿大树胶，然后翻转盖玻片（使有材料的一面朝下），按原来的方向和位置轻轻盖在树胶上。要使盖玻片随着胶的扩展自然下沉，不要施加压力或移动盖玻片。然后平放在阴凉处晾干再镜检。对于镜检符合要求的片子，在载玻片右端贴上标签，注明标本名称，制片日期。[附]冷冻分片法：这种方法快速简单。对准备制作永久片的玻片，先用液态二氧化碳干冰冷冻，或用冰冻致冷器进行冷冻，待完全冷冻结冰后，用刀片将盖玻片同载玻片分开，将载玻片和盖玻片放在37℃左右的温箱内烘干。取出后放在二甲苯内浸泡10～20分钟，滴加树胶封片即可。七、实验作业1．写出制片步骤流程图。\n2．制作两张质量较好的临时片（有条件可制作永久片），并绘出自己所制作片子的分裂相，说明其时期和特点。实验三植物根尖压片技术一、实验目的熟悉细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化，学习并掌握根尖压片技术，为进行细胞遗传学研究奠定基础。二、实验原理有丝分裂是植物体细胞增殖的主要方式。在有丝分裂过程中，染色体不仅复制繁殖了自己，而且通过一系列规律性变化保证了子细胞和母细胞具有同样数目和形态结构的染色体。通过对供试材料进行一定的处理，可以在显微镜下观察染色体的变化特点和染色体的形态特征，进行染色体的计数。由于在有丝分裂的中期染色体具有典型的形态特征，并易于计数，因此为了获得更多的中期染色体图象，可以采用药物处理或冰冻处理的方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。同时通过处理还可使染色体缩短，易于分散，以便于进行观察研究。另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酶处理除去细胞之间的果胶层，并使细胞壁软化。这样使细胞容易彼此散开，有利于压片和染色。三、实验材料圆葱、大蒜、黑麦、玉米、小麦和蚕豆。四、实验用品显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、1/100天平、电炉、温度计、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、滤纸、量筒、量杯、漏斗、培养皿、三角瓶、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签、胶水等。五、实验药品无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、二甲苯、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二氯苯溶液、0.002M8－羟基喹啉、1N协酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶混合液（药品及染色液的配制方法见附录二）。六、实验方法与步骤1．取材：可直接从田间挖取刚长出的幼嫩根尖，也可以在室内培养根尖。室内培养的方法是：（1）圆葱和大蒜根尖：发根前先将圆葱以根部向上在了光下晒两天，然后置于盛清水的小烧杯口上，使根茎部与水接触。或将圆葱半埋于湿沙内。在20～25℃光照条件下培养2～3天，待根长1～2cm时，选健壮根类自尖端约1cm处剪下备预处理用。大蒜作材料可先将蒜瓣扒去皮，然后用细铁丝串起放在盛清水的培养皿内培养，其它要求同上。剪取根尖的时间以上午10时左右为好。（2）玉米（或黑麦、小麦、蚕豆）根类：先将种子浸泡一天，待吸水膨胀后再转移到铺有几层湿吸水纸的培养皿内，上面盖两层湿纱布并加水少许，放在18～20℃黑暗条件下培养40～50小时。待根长到1～2cm时，选健壮根尖于上午10时左右取下备用。2．预处理：为了阻止纺锤体的活动，获得更多的中期分裂相，同时使染色体相对缩短，便于染色体分散和计数，可对根尖进行预处理。预处理的方法有药物预处理和冰冻预处理两种。（1）药物预处理：常用的药物有0.05～0.2%秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002M8\n－羟基喹啉等。预处理时，将根尖直接浸泡在药液中，在适宜的温度下处理一定的时间（表1）。这些药都能使染色体缩短，但对染色体有破坏作用。使用时应注意处理的时间，小麦、黑麦、大麦、圆葱和大蒜等处理4小时左右，棉花和水稻等处理2小时左右。处理的时间长短同温度有很大关系。表1常用药液预处理时间药品条件圆葱玉米小麦0.1%秋水仙素溶液温度（℃）15室温25处理时间（小时）432饱和对二氯苯溶液温度（℃）室温室温处理时间（小时）440.002M8－羟基喹啉温度（℃）18室温处理时间（小时）4（2）冰冻预处理：将根尖浸泡在蒸馏水中，置于1～4℃冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻24小时。这种方法对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，效果良好，简便易行，各种作物都适用。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态，可以不进行预处理。3．固定或前低渗：将预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次（约5分钟），然后转移到70%酒精冰醋酸（3:1）固定液中。在4～15℃条件下固定20～24小时，再用70%酒精冲洗2次转入70%酒精中保存。或者将根尖放入0.075MKCL溶液中低渗20分钟，然后在蒸馏水中冲洗2～3次（约10分钟）。4．解离：解离的方法主要有以下几种（1）将根尖用蒸馏水冲洗2次，然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1N盐酸中。在60℃恒温条件下处理10～15分钟，当根尖透明呈米黄色时取出。（2）将根尖置于2.5%果胶酶和2.5%纤维素酶等量混合液中（PH5～5.5），在室温18～28℃条件下处理2～3小时。（3）将根尖置于95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理2～10分钟。或将根尖放在5N盐酸内处理5～10分钟。5．后低渗：将根尖放在蒸馏水中冲洗2～3次（约10分钟）。酶解后的要尖可浸泡10分钟，然后再冲洗一次。根尖一定要冲洗干净，否则影响染色。低渗后的根尖放入70%酒精中备用。6．染色与压片：染色与压片的方法常用的有以下几种。（1）铁矾苏木精染色压片法：先将根尖放入4%铁矾水溶液中媒染2～4小时。然后流水冲洗20分钟，再将根尖放入0.5%苏木精染液中避光染色40～120分钟，取出后放入蒸馏水中备用。其制片方法，取一染色后的根尖放在干净载玻片的中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片（越薄越好），滴1滴45%冰醋酸，加盖玻片。用一手固定盖玻片，另一手用镊尖或解剖针柄轻敲盖玻片，使材料溃散。用火轻烤载玻片背面，然后继续轻敲，待材料呈云雾状即可镜检。如发现有较理想的分裂相，可再轻烤一下片子，并在盖玻片上盖一张吸水纸，用大拇指用力压片（不可使盖玻片移动），然后镜检。（2）改良卡宝品红染色压片法：将根尖置于干净的载玻片中央，切下根尖分生组织，将其切成薄片，滴一滴改良卡宝品红染色液，盖上盖玻片压片。具体压片方法同上。\n（3）醋酸洋红染色法：取一根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在一张干净的载玻片中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片，滴1滴2%醋酸洋红染色液，盖上盖玻片，进行压片。方法同铁矾苏木精压片法。也可以采用十字交叉压片法。即：取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在干净的载玻片中央。用刀片将分生组织切下，将其切成薄片。取另一张干净的载玻片，呈十字形交叉盖在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸，并用大拇指压片，使材料压成一薄层。然后将两载玻片分开，各滴加1滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片，在酒精灯上轻烤一下片子，一手固定盖玻片，另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打，使根尖细胞分散均匀。7．镜检：压好的片子先在低倍镜下镜检，找到分裂细胞后转换高倍镜观察。如果染色体分散较好，图象清晰，就可以脱水封片，制成永久片。七、实验作业1．制作两张合格的有丝分裂玻片。2．绘出在显微镜下观察到的各期有丝分裂图象。实验四基因的独立分配和基因互作一、实验目的明确机率的概念以及它和基因分离组合的关系；验证和加深对孟德尔分离和独立分配定律的理解；了解几种基因互作的方式。二、实验原理根据分离规律，位于一对同源染色体上的一对等位基因在减数分裂形成配子时，要彼此发生分离，互不干扰地分到不同的配子中去。因此对于一对基因的杂合体，在完全显性条件下，其自交子代和测交子代的表现型分离比例分别为3:1和1:1。在分离规律的基础上，独立分配规律（自由组合规律）进一步揭示了位于非同源染色体上的多对独立遗传基因分离和组合的关系。按照这个规律，位于非同源染色体上的两对基因在减数分裂的过程中，每一对基因都分别按照分离规律进行分离，两对基因之间又可以发生自由组合，结果产生的四类配子比例相等。因此对于两对基因的杂合体，在完全显性条件下，其自交子代和测交子代的表现型分离比例分别为9:3:3:1和1:1:1:1。在基因互作的情况下，上述分离比例则依照基因互作的性质而有不同变化。但是尽管表现型的分离比例不同，而基因分离和组合的关系仍然遵循独立分配规律。一粒玉米杂交种子是由果皮、胚乳和胚三部分组成。它们的世代和遗传基础都不相同。果皮是由子房壁形成的果皮和珠被形成的种皮愈合而成，是母体组织的一部分，为二部体（2n），基因型与母本相同。胚乳和胚是双受精产物，胚为二倍体（2n），胚乳是三倍体（3n），分为糊粉层和淀粉层。玉米的花粉直感现象是显性性状在籽粒上的一种表现，当父本花粉含有显性基因时，它所控制的性状在当代杂种的籽粒上就可能表现出来。某些胚乳和胚的性状常常表现花粉直感现象，而果皮则因与受精无关故不表现直感现象。三、实验材料杂交处理后的不同类型的玉米果穗，固定处理的Wx/wx杂合体花粉。玉米实验材料的制备与保存见附录八。四、实验用品四种不同颜色的玻璃球、硬币、计算器、显微镜、纸袋、回形针。五、实验药品I－KI染色液。六、实验方法与步骤1．杂种分离世代中独立遗传性分离概率的验证：假定有Aa\n杂合体，在减数分裂的过程中A和a必然要发生分离。对于每一基因来说分向细胞任何一极的机率应为1/2，结果产生的两类配子比例相等，即A:a=1:1。雄配子是这样，雌配子亦如此。当雌雄配子受精结合时，由于也是一种随机的过程，结果其自交子代的基因型为1/4AA、2/4Aa、1/4aa。如果某杂合体的基因型为AaBb，当减数分裂形成配子时，每一对等位基因都分别按照分离规律分离，并且每一个基因分到细胞任何一极的机率仍为1/2。由于非等位基因间可以发生自由结合，因此A和B、A和b、a和B、a和b结合在一起的机率各为1/2×1/2=1/4。在受精过程中由于雌雄配子的随机结合，使自交子代出现了9种基因，在完全显性和无互作情况下有四种表现型，其比例为9:3:3:1。（1）基因分离概论的验证：取硬币一枚代表Aa杂合体。画面代表显性基因A，字面代表隐性基因a。抛扔硬币100次，令其自然下落至桌面和倾倒，记载100次中A出现的次数（p）和a出现的次数（q），计算A和a出现的机率。（2）基因组合概率的验证：用红玻璃球表示显性基因A，白玻璃表示其相对的隐性基因a。取纸袋两个，每袋内混合装进红、白球各20枚，每袋代表Aa杂合体。从两纸袋内各随机取出一枚合并在一起并记载两球代号（如AA，Aa，aa），再把两球分别放回原袋内，充分搅拌后再重复以上步骤，共重复100次。统计AA，Aa，aa出现的次数，看是否接近1:2:1。然后，全班统计：是否更接近。（3）两对基因独立分配概率的验证：以红球代表显性基因A，白球代表相对的隐性基因a；绿球代表显性基因B，蓝球代表相对的隐性基因b。取纸袋四个，每两个纸袋用回形针连成双连袋。在每个双连袋内，其中一袋装红、白球各20枚，另一袋装绿、蓝球各20枚，每一双连袋代表－AaBb杂合体。从一个双连袋的每一袋中各取一球合并，表示该杂合体的配子基因型。同样从另一双连袋的每一袋中也各取一球合并，表示另一杂合体的配子基因型，分别记载代号（AB、Ab、aB或ab）。再将两种配子基因型组合成一个个体的基因型。然后将球都分别放回原袋，重复以上步骤100次。统计算出AaBb杂合体产生的配子是否为AB:Ab:aB:ab=1:1:1:1；并且按照AB，Abb，aaB，aabb四种表现型统计AaBb杂合体自交子代的表现型比例是否接近9:3:3:1。然后全班统计看是否更接近。2．一对遗传性状的分析：在玉米中与胚乳有关的许多性状都表现为一对基因的遗传行为，因而其遗传特点都符合分离规律。例如，胚乳的非甜质（Su）为甜质（su）的显性；非糯质（Wx）为糯质（wx）的显性；饱满（Sh）为凹陷（sh）的显性；淀粉层黄色（Y）为白色（y）的显性等。另外糊粉层的紫色是由许多基因相互作用的结果。纯合紫色糊粉层个体的基因型一般可简写为ACRPr。对于A或C位点来说，如果某个体有一对基因处于杂合时，则其自交子代和测交子代的表现型分离比例分别为紫:白=3:1和紫:白=1:1，也符合分离规律的表现特点。上述这些性状都表现花粉直感现象。（1）仔细观察区别玉米籽粒的甜质（susu），非甜质（Su▁）；糯质（wxwx）、非糯质（Wx）；白淀粉层（yy）、黄淀粉层（Y）；紫糊粉层（A）、白糊粉层（aa）；凹陷（shsh）、饱满（Sh）的表现型特征。（2）取糯质与非糯质的杂种F1（Wxwx）花药制成临时片，用1%I－KI液染色，置低倍镜下观察，取样（每片取5个视野）计数蓝黑色花粉粒（非糯质）和棕黄色花粉粒（糯质）的数目。（3）取杂合非甜（Susu）、杂合黄淀粉层（Yy）、杂合紫糊粉层（Aa）玉米的自交和测交果穗，区别果穗上的不同表现型，计数各类表现型的籽粒数。（4）为了检验所得的实际结果与理论值是否相符，对从玉米果穗上获得的结果用标准误差法进行检验（见附录十）。\n首先算出实际观察值（O）与理论值（C）之间的偏差（D），（D=O－C），然后算出标准差S·E，再求D/S·E。（式中C1和C2分别表示两组理论值的个体数，n为总数）。当D/S·E＞2.0时表示实际结果和理论推断之间差异显著，不符合。当D/S·E＜2.0时则表示实际结果和理论推断相符，差异不显著。3．两对独立遗传性状的分析：玉米籽粒胚乳的甜质（susu）和非甜质（SuSu），黄色（YY）和白色（yy）是两对相对性状，分别由位于两对非同源染色体上的两对基因所控制。当纯合的黄色非甜（YYSuSu）同白色甜质（yysusu）杂交时，F1为黄色非甜质。使F1自交后其子代产生四种表现型，分离比例为9:3:3:1；使F1同双隐性个体测交其子代四种表现型的分离比例为1:1:1:1。（1）取杂合的黄色非甜质（YySusu）玉米的自交和测交果穗，区别上面的表现型，并计数各类表现型籽粒数。（2）以所得结果用X2法进行检验。式中O表示实际观察值，C表示理论值，∑为积加符号。求得X2后，根据相应的自由度（n-1，n表示观察的表现型组数），查P值表（见附录十一）。如果P＞0.05，就表明观察结果与理论值相符合，差异不显著；如果P＜0.05，则表明实际结果和理论值不相符合，差异显著。4．基因互作的遗传性状分析：玉米糊粉层色素的形成涉及四个基础基因A1、A2、C、R。当这四个位点上都存在显性基因时，糊粉层表现有色。在这个基础上如果显性Pr存在，糊粉层表现紫色，如果隐性pr存在则表现红色。在这四个基础基因中只要有一个位点为隐性，糊粉层都表现无色。当用两个分别缺少一个不同色素基因的无色糊粉层亲本相互杂交时，F1都表现有色，F2分离为9有色:7无色，这种互作方式称为显性互补。例如，a1a1A2A2CCRRPrPr×A1A1a2a2CCRRPrPr，F1的基因型可写为A1a1A2a2（略CCRRPrPr三对纯合基因），表现紫色。F2将分离为9紫（A1A2）:7白（3a1a1A2+3A1a2a2+1a1a1a2a2）。在C位点上存在着若干个复等位基因如C、c、CI。CI是一种显性抑制基因，只要CI存在，无论其它基因如何，籽粒糊粉层都表现无色。因此当以a1a1CC与A1A1CICI两个无色糊粉层的亲本杂交时，F1（A1a1CIC）籽粒的糊粉层表现无色，F2将分离为13无色（9A1CI+3a1a1CI+1a1a1CC）:3有色（A1CC），这种互作方式称为抑制作用。由上可见，a1，a2，c，r任一位点为隐性时，对Pr基因都具有上位作用。例如以A1A1prpr（红糊粉层）与a1a1PrPr（无色）杂交，F1（A1a1Prpr）表现为紫色，F2则分离为9紫（A1Pr）:3红（A1prpr）:4无色（3a1a1Pr+1a1a1prpr），这种互作方式称为隐性上位。（1）取杂合玉米（AaCc或A1a1A2a2）的自交果穗，观察计算果穗上表现型的种类及比例。（2）观察玉米杂合体（A1a1CIC）自交的果穗，统计表现型种类及比例。（3）观察玉米杂合体（A1a1Prpr）的自交果穗，统计表现型种类及比例。（4）以所得结果用X2法进行检验。七、实验作业1．将自己和全班的相对性状分离概率验证的结果填入表2、表3。\n表2一对基因分离概率的结果表数据来源基因分离的机率基因组合的机率抛扔次数A出现的次数(p)a出现的次数(q)取样次数AA出现的次数(p2)Aa出现的次数(pq)aa出现的次数(q2)本人全班表3二对基因分离概率的结果表数据来源各类配子数目及比例表现型种类及比例ABAbaBabABAbbaaBaabb本组杂合体甲数目比例杂合体乙数目比例合计数目比例全班数目比例2．将一对遗传性状的分析结果填入表4，并说明实际观察结果与理论推断是否符合。表4一对遗传性状的分析结果表类别观察值（O）理论值（C）D（O－C）S·ED/S·E自交果穗显性隐性测交果穗显性隐性3．将两对独立遗传性状的分析结果填入表5，并作适当说明。现表5两对独立遗传性状的分析结果表项表目果穗型观察值（O）理论值（C）（O－C）P值自交果穗测交果穗4．将基因互作的分析结果填入表6，并作适当的解释。\n表6基因互作性状分析结果表现项表目果穗型观察值（O）理论值（C）O－CP值显性互补抑制作用隐性上位实验五果蝇的形态鉴别和饲养管理一、实验目的了解果蝇的生活史及各个发育阶段的形态特征，区别雌、雄果蝇和几种主要性状的常见突变型，掌握实验果蝇的饲养管理以及杂交实验的处理方法。二、实验原理普通果蝇（Drosophilamelanogaster）在分类上属昆虫纲、双翅目、果蝇属。它作为遗传学研究的材料是因为它具有以下几个优点：1．饲养简单，凡能在室内发酵的东西都可以作为饲料。2．生活周期短，繁殖快。在25℃时由卵到成虫只需10天左右，并且易于获得较大的后代群体。一对果蝇交配后可以产生400～500个甚至上千个卵。3．染色体数目少（2n=8）。第一号染色体为性染色体，第二、三号染色体是两对近等臂染色体，第四号是粒状染色体。4．能够经常见到突变个体，且多为形态性状突变，易于观察。5．幼虫的唾腺染色体具有体细胞联会的特点，并且唾腺染色体是一种巨型多线染色体，可比正常染色体大100～200倍。在普通光学显微镜下就能看到染色体上具有不同的带纹，是研究染色体结构变异的好材料。三、实验材料饲养的野生果蝇和几种常见突变型果蝇。四、实验用品双筒解剖镜、放大镜、镊子、解剖针、麻醉瓶、培养瓶、白瓷板（15cm×15cm）、粗头毛笔。五、实验药品乙醚、70%酒精、琼脂、玉米粉、蔗糖、酵母（新鲜的或干粉）等。六、实验方法与步骤1．果蝇的饲养管理\n（1）果蝇的生活周期：果蝇的一生经过卵一幼虫一蛹一成虫四个阶段。生活周期的长短受温度影响很大，一般以20～25℃为适宜。当温度低于10℃时，生活周期延长，而且生活力明显下降。温度高于30℃时则引起不育和死亡。在25℃条件下，果蝇各发育阶段所需时间大致是：羽化成虫12小时后交配2天产卵1天一龄幼虫1天二龄幼虫1天三龄幼虫3天化蛹3～4天成虫（成虫可活15天左右，低温时可活一个月左右）。生活周期与饲养温度的关系可见表7。表7果蝇生活周期时间表温度时期10℃15℃20℃25℃卵－幼虫8天5天幼虫－成虫57天18天6.3天4.2天（2）培养基的制备及饲养管理：果蝇是以酵母菌作为主要食料。在实验室内凡能发酵的基质都可用作饲料。常用的是玉米饲料。几种饲料配方见表8：表8果蝇饲料配制表类型原料玉米饲料米粉饲料香蕉饲料水（毫升）15010050琼脂（克）1.521.6蔗糖（克）1310－香蕉浆（克）－－50玉米粉（克）17－－米粉（克）－8－麸皮（克）－8－酵母粉（克）1.41.41.4丙酸（毫升）110.5～1下面以玉米饲料为例，说明配制的方法。按配方将琼脂破碎放入约为总量2/3的水中煮溶，加入蔗糖搅拌溶解煮沸，将玉米粉同余下的1/3水调成糊状倾入正在煮沸的琼脂——蔗糖液中，不断搅拌。煮沸几分钟至成粘稠均匀的糊状为止。然后加入丙酸和酵母搅匀分装到已经灭菌的培养瓶中，每瓶1～2cm厚即可。装饲料瓶时应注意避免饲料沾到瓶口和瓶壁上。待饲料冷却后，用酒精棉球擦干净饲料瓶内壁，再插入消毒后的吸水纸（纵向折叠或卷成筒状插入，便于成虫栖息和幼虫化蛹），最后用灭菌的纱布棉塞好瓶口备用。当饲料瓶装好后，最好过1～2天再移进果蝇。在果蝇的饲养过程中应避免日光直晒，当瓶内果蝇繁殖到相当数量后，或饲料发霉干枯时应及时将果蝇转移。对于留种的果蝇原种可放在10～15℃条件下培养，使生活周期加长，减少转移次数，注意防止混杂。2．观察方法：为便于细致地观察或鉴别，需要将果蝇进行麻醉处理。麻醉时可使用专用的麻醉瓶，也可以用适当大小的广口瓶代之，用纱布包裹棉团作塞子。麻醉时，先取下麻醉瓶塞，然后取过培养瓶，轻拍瓶壁，使果蝇落在培养瓶底部，用右手两指取下培养瓶的棉塞（夹在指间不要放下），迅速把麻醉瓶口同培养瓶口严密对接。用左手握紧两瓶接口翻倒过来，使培养瓶在上，麻醉瓶在下，右手轻折培养瓶将果蝇震落麻醉瓶内，迅速盖好两个瓶塞。也可以使培养瓶在下，麻醉瓶在上，去塞对接瓶口后用黑纸遮住培养瓶，使果蝇因趋光而移入麻醉瓶，当达到一定数量后迅速将两瓶口盖好。当果蝇进入麻醉瓶后，轻拍瓶壁并迅速取下瓶塞，在瓶塞上滴3～5滴乙醚，然后迅速\n塞紧瓶口。约经半分钟果蝇便被麻醉塞紧瓶口。约经半分钟果蝇便被麻醉。应注意切塞紧瓶口。约经半分钟果蝇便被麻醉。应注意不可直接在培养瓶内麻醉。果蝇被麻醉后，可将其倾倒在用酒精擦过的白瓷板上进行观察鉴别。观察过程中如果发现果蝇开始苏醒，可用一张吸水纸滴加几滴乙醚放在培养皿内，然后将培养皿盖住，果蝇再次被麻醉。如果观察的果蝇还要继续培养利用，应注意不要将其麻醉过度，如果蝇翅外展同身体呈45°角则表明已麻醉致死。麻醉观察后的果蝇如再培养可先将培养瓶平放桌上，取下瓶塞，在果蝇苏醒前用粗头毛笔将其转移进瓶内。应注意可先将果蝇放在倾倒的瓶壁上，然后塞好瓶口待其苏醒后再将培养瓶竖起。3．性别鉴定：成虫的雌雄鉴别很明显，可以用放大镜或直接进行观察鉴别。它们的主要特点如表9所列。表9雌雄果蝇性状比较表观察性状雌蝇雄蝇体型较大较小腹部性状似椭圆形，较膨大，末端尖似圆筒状，末端钝圆腹部背面5条黑色条纹3条黑色条纹，前两条细，后一条宽而延伸至腹面，呈一明显的黑斑腹部腹面6个腹片4个腹片第一对前足无性梳有性梳一般用肉眼对体型和上述腹部的三个特点进行观察，就可以把雌雄区别开。但是对刚羽化出的成虫或个别难以区别的成虫有时必须用解剖镜观察性梳的有无。所谓性梳（Sexcombs）是指第一对足的跗节基部的一撮黑色鬃毛状物。雌、雄果蝇的外部形态及雄蝇的性梳见图4、图5。图4果蝇的外部形态\n图5雄性果蝇的左前足左、中、示跗节基部的性梳右、雌性无性梳1．基节2．转节3．腿节4．胫节5．跗节4．几种常见突变型的观察：实验用的普通果蝇常见类型及其形态特征见表10。表10果蝇常见类型及其形态特征名称基因符号性状特征白眼（White）w复眼白色棒眼（Bar）B复眼横条形，小眼数少黑檀体（Ebony）e身体呈乌木色，黑黑体（Black）b体黑色比黑檀体深黄体（Yellow）y全身呈浅橙黄色残翅（Vestigial）vg翅明显退化，部分残留，不能飞焦毛（Singed）sn刚毛卷曲如烧焦状七、实验作业绘出自己所观察到的雌雄蝇外部形态，性梳。实验六果蝇的伴性遗传分析一、实验目的了解伴性遗传与常染色体遗传的区别。二、实验原理性染色体上的基因所控制的性状，在遗传方式上与常染色体上的基因有所不同，性染色体上的基因随性染色体而遗传。因此这些基因所决定的性状常与性别有联系，称为伴性遗传。已知果蝇的红眼（野生型）和白眼（突变型）是一对相对性状，决定这一对相对性状的基因位于X染色体上，而Y染色体上没有与它相对应的基因。因此当以红眼果蝇同白眼果蝇杂交时，正反杂交结果不同，表现伴性遗传。若以“+”代表红眼基因，“w”代表白眼基因，“+”是“w”基因的显性，则正、反杂交结果如下。正交：P♀红眼（X+X+）×白眼（XwY）♂♂↓\nF1♂♀XwYX+X+Xw红眼X+Y红眼F1同群内交配↓F2♂♀X+YX+X+X+红眼X+Y红眼XwX+Xw红眼XwY白眼反交：P♀白眼（XwXw）×红眼（X+Y）♂↓F1♂♀X+YXwX+Xw红眼XwY白眼F1同群内交配↓F2♂♀XwYX+X+Xw红眼X+Y红眼XwXwXw白眼XwY白眼三、实验材料红眼和白眼果蝇。四、实验用品双筒解剖镜、放大镜、镊子、解剖针、麻醉瓶、培养瓶、白瓷板、粗头毛笔、标签、胶水等。五、实验药品乙醚、95%酒精。六、实验方法与步骤1．选择处女蝇：用于杂交实验的雌蝇必须为处女蝇，雌蝇在孵出后12小时内一般不进行交配。获得处女蝇的方法是：在杂交前先将已孵化出的果蝇从培养瓶中全部移出，以后每隔6～8小时将新孵化出来的幼蝇进行鉴别，把雌雄蝇区别开隔离饲养，以用作杂交亲本。2．杂交（1）每组正反杂交各2瓶，每瓶内放5对。贴上标签，注明杂交组合、日期、实验者姓名，放在20～25℃条件下培养。第二天检查一下亲本果蝇的成活情况，如有死亡应给予补充。（2）7～8天后移出全部亲本果蝇，并观察该对亲本的性状。（3）再过4～5天，F1成蝇孵出。检查F1成蝇100～200只，看其眼色与性别的关系，并作记录。\n（4）从正反杂交组合中分别选5对F1成蝇进行互交，此时可不必选处女蝇。同时另选取F1红眼处女蝇和亲本白眼雄蝇各5只进行回交。（5）7～8天后移出全部亲本果蝇，在F2和回交子代成蝇孵出后分别观察100～200只，记录不同类型的数目。将实验结果填入表11。表11果蝇杂交后代性状分析结果表类世型组合代雌蝇雄蝇红眼白眼红眼白眼正交F2种类比例Ft种类比例反交F2种类比例Ft种类比例3．结果分析：对获得的实验结果进行X2检验，分析是否符合预期结果。七、实验作业1．根据实验结果，结合伴性遗传理论，表示杂交各代的基因型和表现型的种类和比例。2．根据X2检验结果说明自己的实验结果同理论期望是否符合。实验七基因的连锁交换与基因定位一、实验目的通过对玉米籽粒性状连锁和交换的观察及统计分析，验证基因连锁和交换的基本规律。以玉米、果蝇为实验材料，掌握基因定位的基本方法。二、实验原理连锁遗传规律阐明了位于一对同源染色体上的连锁遗传基因分离和组合的关系。由于连锁遗传基因在分离和组合过程中的相互影响，致使杂合体所产生的各类配子比例不等，其自交和测交子代表现型的分离比例也因重组率的不同而异，但总是重组型少、亲型多。由于基因在杂色体上的位置和距离不同，基因之间的连锁强度也不相同。基因在染色体上的相对距离可以用重组率表示。决定玉米胚乳性状的某些基因有连锁遗传现象，可以采用两点或三点测验法获得分离果穗，通过对籽粒性状的观测分析求得重组率，从而决定基因在染色体上的排列顺序和遗传距离。已知控制果蝇某些性状的基因位于X染色体上，雄果蝇的Y染色体上不带有同X染色体上相对应的基因。因此，在雄果蝇中表现为完全连锁遗传。通过野生型和突变型果蝇杂交，再使其杂种同隐生纯合亲本测交，根据对测交子代的分析也可以确定基因的位置和距离。三、实验材料1．玉米紫色、饱满籽粒自交系与褐色、凹陷籽粒自交系的杂种一代（F1）果穗以及同褐色、凹陷亲本的测交果穗。2．野生型和具有白眼（w）、小形翅（m）、卷刚毛（sn）的突变型果蝇。四、实验用品双筒解剖镜、放大镜、解剖针、计算器、粗头毛笔、白瓷板、培养瓶、麻醉瓶等。\n五、实验药品乙醚。六、实验方法与步骤1．玉米胚乳性状连锁基因重组率的测定：当两对基因为连锁遗传时，F2和测交子代的分离比例明显不同于独立遗传，表现为亲型个体数明显多于理论值，而重组型个体数明显少于理论值。可见重组型的产生并不是非同源染色体自由组合的结果，而是同源染色体上连锁基因间发生交换重组而产生的。在玉米中，决定糊粉层色泽紫色与褐色、籽粒形状饱满与凹陷的基因都位于第九染色体上，表现为连锁遗传。使紫色、饱满（BzSh/BzSh）的个体与褐色、凹陷（bzsh/bzsh）个体杂交，F1为紫色、饱满（BzSh/bzsh）。使其与隐性亲本测交，根据测交后代的表现型种类和比例就可以确定这两对基因间的距离。（1）观察杂合体（BzSh/bzsh）同隐性亲本的测交果穗，区别不同的表现型，计数各类籽粒的数目。（2）计算bz－sh之间的重组率。（3）将连锁遗传的分析结果填入表12。表12玉米果穗两对性状连锁遗传分析结果表表现型总数基因型观察数重组率（%）2．果蝇连锁基因的三点测验（1）使白眼、卷刚毛、小形翅突变型处女蝇与野生型雄蝇交配，每瓶5对。待化蛹后除去亲本成蝇，羽化后鉴定杂种蝇。F1的雌蝇应该为红眼、直刚毛、长翅，而雄蝇表现为白眼、卷刚毛、小形翅。（2）将F1雌蝇同突变型雄蝇交配，7～8天后移出亲本蝇，以测交子代成虫出现开始，每两天观察一次，将结果填入表13。（3）分析计算①根据实验结果确定三对基因的遗传关系。即三对基因是独立遗传还是连锁遗传，或一对独立两对连锁。②确定各类交换类型和亲型。③确定三对基因的排列顺序，分析双交换类型，如果有两对性状出现了还原为亲本的组合类型，则决定第三对性状的基因必在中间。④计算重组率：表13果蝇三对性状连锁遗传分析结果表类别基因型表现型个体数每组合计每组占总数%交换情况亲型+++红眼直刚毛长翅wsnm白眼卷刚毛小翅单交换Iw++白眼直刚毛长翅+snm红眼卷刚毛小翅\n单交换II++m红眼直刚毛小翅wsn+白眼卷刚毛长翅双交换w+m白眼直刚毛小翅+sn+红眼卷刚毛长翅⑤绘制连锁图：以1%作为一个距离单位，按照基因的排列顺序，绘出连锁图。七、实验作业将玉米和果蝇的实验结果写成实验报告。实验八果蝇唾腺染色体的观察一、实验目的1．掌握剖离果蝇三龄幼虫唾腺及压制唾腺染色体玻片标本的方法。2．根据唾腺染色体上带纹的形态和排列识别不同的染色体。二、实验原理在果蝇幼虫的唾腺细胞内，4对染色体是分别同源联会着的，即“体细胞染色体联会”。在唾腺细胞停止细胞分裂之后，这些染色体的染色线仍然继续复制达数百次，通常称为“多线染色体”。所以果蝇唾腺染色体的DNA含量为正常体细胞内染色体的1000多倍，由于唾腺染色体的这种巨大性便于观察，因此，根据唾腺染色体上带纹的形态和排列可识别不同的染色体，也是研究和鉴别果蝇染色体结构变异的好材料。三、实验材料普通果蝇的野生型或任何突变型的三龄幼虫活体。四、实验用品双筒解剖镜、显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、酒精灯、吸水纸、铅笔。五、实验药品醋酸洋红、生理盐水（0.7%NaCl）。六、实验方法与步骤1．幼虫的培养：对用来观察唾腺染色体的果蝇幼虫，要给予较好的培养条件。一般要求培养瓶内幼虫不应过多，最好每隔两天将羽化的新蝇移出一次，以免在瓶内产生过多的卵。在较低的温度下培养（16～18℃），长成的幼虫较大。唾腺应取自充分发育的三龄幼虫（图6）。此龄幼虫的唾腺充分得到发育、个体最大，而且常常爬到培养基外或瓶壁上。\n图6果蝇三龄幼虫的图解2．唾腺的剖取：选取发育良好的三龄幼虫，放在干净的载玻片上，然后滴上一滴生理盐水，一手持镊子，一手持解剖针，用镊子压在虫体中部的稍后处，不使其移动；用解剖针按在头部黑点处稍后（口器稍后），轻缓地向前移动，便可将头部扯开，唾腺也随之拉出（图7）。这时可看到一对透明而微白的长形小囊即唾腺。在腺体的前端各延伸出一条细管，并向前延伸汇合为一条，形成一个三叉形唾腺管。果蝇的唾腺是由单层细胞构成的，在解剖镜下有时隐约可见细胞界限。唾腺的两侧常常有少量沫状脂肪体，可用针剥离掉图7剖取果蝇幼虫唾腺的方法后再进行染色，以免影响染色效果。如唾腺被拉断或未被拉出，可用解剖针在虫体前部1/3处轻轻向前挤压出来。3．染色压片：将唾腺放在染色皿内或载玻片上，吸去沾带的生理盐水，滴加一滴醋酸洋红，染色15～20分钟。注意在剖取和染色时不要使腺体干燥。取一条已染色的唾腺（或切取一部分），放到一张载玻片上，加一滴2%醋酸洋红染色液，盖上盖玻片，或在酒精灯上稍微加热，覆上一张吸水纸，用铅笔橡皮前沿端或解剖针杆轻敲几下，然后用拇指适当用力压片，要求将唾腺细胞核压破，染色体伸展开但不断裂、破碎为好。4．观察：压好的玻片标本，先进行低倍观察，当见到自由分散的染色体后，换高倍镜观察。压片适当的材料可见四对染色体中，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ\n染色体都以中部着丝粒区聚集，各自的两个等臂染色体区段自然弯曲分散，而第四对染色体很小，呈一点状或盘状，它们都以着丝粒为联结点，构成染色中心，即染色制片时染色体常常密集的区域。对染色体分散比较均匀、清楚的制片，可继续用高倍镜仔细观察或用油镜观察每条染色体自顶端的横向带纹、带宽的大小，带纹的排列顺序，并以此同模式图（图8）对照区别。图8雌性果蝇唾腺染色体模式图X、性染色体2R、第二染色体右臂2L、第二染色体左臂3R、第三染色体右臂3L、第三染色体左臂4、第四染色体七、实验作业1．绘出镜检时所观察到的染色体图形，并画出各臂较为明显的带纹5～10条，注明第几号染色体和哪一条臂。2．选出较好的压片，做成永久性玻片标本。实验九红色面包霉的分离和交换一、实验目的通过红色面包霉的杂交实验，观察与分析子囊孢子的性状表现，从而认识和验证分离和交换规律。二、实验原理红色面包霉在分类学上属于子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属。通常用做实验的是Neurosporacrassa，亦称粗糙链孢霉，其菌丝体是单倍的（n=7），每一菌丝细胞中有几十个核，野生型菌丝体有两种分生孢子，小型分生孢子中有一个大核，大型分生孢子中有几个核。生殖过程中，菌丝体的片段或萌发的分生孢子，经有丝分裂有直接发育成菌丝体，为无性生殖。有性生殖是通过两种方式进行的，其一是，一种结合型菌株的分生孢子，落在另一种接合型菌株的原子囊果的受精丝上，分生孢子的细胞核进入受精丝中形成异核体，约经过7～10次的双核分裂（有丝分裂），最后两种接合型的核融合为合子核，并随之进行减数分裂，形成四个单倍性核，接着每个核又进行一次有丝分裂，结果每个子囊中含有8个子囊孢子。另一种是，两种接合型菌株的菌丝连接，进而发生核的融合，然后合子核以上述同样的步骤形成原子囊果和孢子。只有不同接合型的菌株经过结合才产生含有子囊的原子囊果，每个子囊的大小20×200微米，而每个子囊孢子约17×26微米，因此8个子囊孢子通常是有顺序的排列在子囊中。它们又是减数分裂的产物，包括由此发育的菌丝体都是单倍性细胞，所以两个相对性状可以直接表现出来（图9）。同时，8个孢子存在于一个子囊中，又依序排列，所以很容易分辨出基因的分离效应。如：野生型的子囊孢子成熟为黑色，赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟而呈灰色，这样通过孢子的颜色和不同排列，便可直观地证明有关基因的分离和交换。\n图9红色面包霉的生活史1．2．子囊子发芽3．4．菌丝体5．6．分生孢子发芽7．菌丝融合8．9．原子囊果与分生孢子10．分子三、实验材料1．Neurosporacrassa的野生型（+）。2．赖氨酸缺陷型（Lys-）。四、实验用品普通显微镜、钟表、镊子、解剖针、载玻片、大试管、三解烧瓶、高压锅、电炉、培养箱、接种针等。五、实验药品蔗糖、酒石酸胺、氯化钙、氯化钠、生物素、硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸铵、磷酸钙、叶酸、硫胺素、氯化胆碱、肌醇、对氨基苯酸、核黄素、吡哆醇、氨基酸、维生素、琼脂、5%次氯酸钠、5%石碳酸（培养基配制见附录四）。六、实验方法与步骤1．接种杂交：在无菌的条件下，取野生型（+）和赖氨酸缺陷型（Lys-）的少许菌丝，接在同一试管的玉米琼脂培养基上，共接两支，然后在25℃恒温箱中培养2～3周，当出现棕黑色的子囊果时，即可收集子囊进行观察统计。2．子囊的收集：在长有黑色子囊果的试管中，加入少量的无菌水，摇动片刻，倒在空三角瓶中，加热煮沸5分钟以上，以防止分生孢子飞扬。3．观察分析：取一片载玻片，滴上1～2滴5%次氯酸钠溶液，然后用接种针将子囊果取出放在载玻片上（若附着在子囊果上的分生孢子过多，可先在5%的次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上）在双筒解剖镜或低倍显微镜下（150X），用解剖针在子囊果，要求将子囊果压开，大量完整的子囊刚好充分压散而未破，从散开的子囊中观察子囊孢子在子囊中的排列顺序，并分析分离和交换的表现。在观察子囊孢子时，要掌握适当的时期，如果偏早，虽有子囊但孢子未成熟，无论野生型和缺隐型者都显白色；如果过迟，则孢子未成熟为黑色，即无从辨认了。在适当的时期中，可见到8个子囊孢子中4个黑色为野生型（+），4个白色为赖氨酸缺陷型（－），它们有六种排列顺序：（1）++++――――（2）――――++++（3）++――++――（4）――++――++（5）++――――++\n（6）――++++――图10红色面包霉中野生型和赖氨酸缺陷型的杂交子囊孢子的排列（6种排列）野生型孢子成熟较快，呈现黑色（1）、（2）两种排列方式说明两种类型的子囊孢子发生分离，但无交换。（3）、（4）、（5）、（6）不仅有分离，而且有交换（图10）。在正常的情况下，不论有无交换，分离结果野生型（黑）与缺陷型（白）的孢子比例均为1:1。但有时也能出现异常的分离比例，野生型（黑）与突变型（白）的孢子比例不是1:1而是6:2，2:6，3:5，5:3。这种现象是由于基因转换的结果。4．观察统计和交换值的计算：观察若干子囊果，记录每个完整的子囊型。根据统计观察数据按下式计算交换值：5．实验注意事项（1）实验用过的接种针要过火灭菌。（2）镊子放入次氯酸钠中浸泡5分钟后洗净。（3）三解瓶中的液体要煮沸5分钟后，才能倒掉。（4）用过的载玻片随即放入石碳酸中浸泡，以杀死子囊孢子，过一段时间后取出、冲洗、擦干。七、实验作业1．链孢霉的分离现象与高等植物有什么不同？2．结合都课书中的有关章节，说明什么是交换？3．计算交换值为什么要除以2？、、、、、、实验十遗传力的估算一、实验目的认识数量性状的特性和了解遗传力的概念；统计分析某些数量性状遗传的试验数据，练习估算遗传力的方法。二、实验原理生物变异是普遍存在的，对于作物的数量性状来说，其变异既受基因型也受环境因素的影响。用各项数值的方差可表示为：VP（表现型方差）=VG（基因型方差）+VE（环境方差）\n由此，在表现型方差中，若能知基因型方差占多大的比例，则在遗传和育种工作中有一定的意义。如果比例较大，那么根据表现型选出的优良个体的基因型就有较大可能传给后代，从而便于选育出优良性状的品种；反之，若环境方差占的比例过大，则不利于选育新品种。这种某数量性状由亲代传递给后代的相对能力，一般称之为遗传力，以h2%表示。更确切地说，把整个基因型方差（VG）占表现型总方差（VP）的百分率称为广义遗传力，即：基因型方差又可进一步分为加性方差（VA）、显性方差（VD）和基因互作的上位性方差（VI）三个组成部分。其中只有加性方差是可以固定的遗传部分。而显性方差和上位性方差均不能固定，将随世代递增而逐渐消失。因此，更确切地估计遗传力应以加性方差占表现型方差的比例表示，这就是狭义遗传力，即：根据遗传力的估算，可以了解一些数量性状的遗传变异和环境变异的情况，从而认识和比较数量性状传递给后代能力的强弱，以提高选择的预见性及效果，并为确定适当的选择方法提供依据。三、实验材料田间种植的玉米自交系（P1、P2）、杂交种（F1、F2）和回交种（BC1、BC2）的植株。四、实验用品钢卷尺、米尺、计算器。五、实验方法与步骤1．田间调查和整理资料：分组调查在不同环境条件下，同一年种植的不同自交系，不同自交系为杂交亲本的F1和F2及回交一代（BC1、BC2）的株高，叶片长、宽及果穗长度，并将其原始资料分组后填入表14。表14玉米自交系、杂种、回交后代资料统计表（其它性状略）世代株高（cm）NVS1234567891011121314151617181920P1P2F1F2BC1BC2N：观察个体数；：平均数V：方差S：标准差2．计算平均数、标准差和方差：求算公式：\n3．广义遗传力的估算：先求环境方差。一般自花授粉作物或异花授粉作物的自交系，以及它们的杂种一代的基因型是相对一致的。它们的群体变异是属于环境引起的非遗传变异。因此，通常可用P1、P2及F1群体的方差平均数作为环境方差。F2群体的方差除基因型方差外还有环境方差，因此，F2表现型方差中减去环境方差即得到基因型方差：然后按下式求出广义遗传力。广义遗传力是指基因型方差占总方差的百分比值：或4．狭义遗传力的估算：是利用不同世代的杂种群体抵消环境方差和基因型方差中的显性方差，从基因型方差中分离出加性方差来估算遗传力的方法。狭义遗传力，是指加性方差占总方差的百分比值。根据理论计算F2表现型的变量为：BC1的遗传方差：BC2的遗传方差：BC1+BC2的遗传方差：那么两个回交一代表现型的变量为：那么\n5．最少基因数目的估算：设某性状受K对基因支配，并假定两纯种亲本都是极端类型，一个亲本中全为（+）向基因，一个亲本中全为（－）向基因；各个基因的效应都相同；没有显隐关系和上位作用；所有基因都无连锁关系，那么：查F2中遗传方差分量为：代入上式：解K得：式中是环境方差，可根据P1、P2、F1表现方差估计。杂种后代中常有一定程度的显性，利用所得的遗传方差，可能包括显性方差，从而夸大了个别基因的作用，低估了基因的数目。显性作用越大，所造成的偏差就越大。故改用以下公式估计：六、实验作业1．根据所得数据，分析本实验中玉米三个性状的遗传特点，并估算广义、狭义遗传力，最少基因对数。2．分析说明玉米的三个性状中，自交系和杂种间F1、F2、回交一代间所表现差异的原因；以及自交系、F2、回交一代群体内个体间表现差异的原因；实验材料在种植的时间、地点方面有什么要求。实验十一植物染色体组型分析一、实验目的学习和掌握植物染色体组型分析的方法，为进行细胞遗传学和遗传育种学的研究奠定基础。二、实验原理\n染色体是生物细胞内遗传物质的主要载体，各种生物染色体的形态、结构和数目都要相对稳定的。每一生物细胞内特定的染色体组成叫做染色体组型。按照一定的方法制得染色体玻片标本后，再经过显微照相、放大和洗印获得染色体照片。通过对染色体玻片标本和染色体照片的对比分析，可以对细胞内的染色体进行分组，并对组内各染色体的形态特征进行观测和描述。从而阐明生物的染色体组成，确定其染色体组型，这种过程称为染色体的组型分析。在细胞遗传学、分类学和遗传育种学等方面的研究中，染色体组型分析是一种十分重要的研究手段。三、实验材料大麦（2n=14）、黑麦（2n=14）、玉米（2n=20）、圆葱（2n=16）。四、实验用品显微镜、显微照相和冲洗、放大的全套设备，目镜测微尺、镜台测微尺、计算器、透明直尺、剪刀、镊子、铅笔、坐标纸、绘图纸、胶水以及制作染色体玻片标本所需要的其它用品（参见实验二和实验三）。五、实验方法与步骤进行染色体组型分析可以利用体细胞有丝分裂时期的染色体，也可以利用性母细胞减数分裂时期的染色体。1．有丝分裂时期的染色体组型分析：（1）制作染色体玻片标本：利用有丝分裂时期的染色体进行组型分析，通常是采用根尖细胞有丝分裂的中期染色体。因为这一时期的染色体具有明显的形态特征，便于进行分析。获得有丝分裂中期染色体玻片标本的方法，可参照实验三进行。（2）镜检测量：当染色体玻片标本制好以后，放在显微镜下检查，选出至少3个符合染色体组型分析要求的细胞。这些细胞应该是处于有丝分裂中期，染色体分散良好无重叠，细胞内各条染色体处于同一平面，并且着色鲜明，形态清晰，着丝粒明显。如果染色体带有随体应明显可见。经过显带处理，染色体应带纹清楚。然后在细胞内选取一条较平直的染色体，用目镜测微尺量取其长度，以用于计算放大倍数。（3）显微照相、冲洗和放大：将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行显微照相、冲洗。然后选取图象清晰的底片，放大洗印出染色体形态清晰的照片（药液的配制见附录六）。每个细胞至少5张。（4）测量染色体的照相长度：在放大的照片上用透明尺准确地量出各条染色体的总长度和每条染色体两臂的长度，并将结果填入表15。在测理时，对于随机染色体中随体的长度可以计入或不计入染色体长度之内，但应注明。对于每条染色体的着丝粒应平分为二，计入两臂长度之内。如果染色体弯曲不能用直尺测量时，可以先用细线量取与染色体相等的长度，然后再用尺子量出线的相应长度。（5）计算：根据测量结果计算出放大倍数、绝对长度、相对长度、臂比，并将有关结果填入表15。①放大倍数的计算：计算放大倍数是利用在显微镜下直接测得的某平直染色体的实际长度（μ），除以放大照片上的相应染色体的照片长度（μ）。②绝对长度的计算：某染色体（或臂）的绝对长度③相对长度的计算：某染色体（或臂）的相对长度\n④臂比的计算：表15染色体形态测量数据表染色体编号照相长度（mm）绝对长度（μm）相对长度臂比带型染色体类型备注长臂短臂全长长臂短臂全长（6）剪贴及配对：把放大照片上的各条染色体剪下，根据目测和染色体的相对长度，臂比、着丝粒的位置，次缢痕的有无和位置，随体的有无和形态大小等特征，将同源染色体逐对配好。（7）排列及分类：将配对的染色体按照由大到小的顺序依次排列起来。排列时把各对染色体的着丝粒排在一条直线上，并且使短臂在上，长臂在下。对于长度相同的染色体要把短臂较长的染色体排在前面。随体染色体排在最后或单独排列。如果有性染色体和超数染色体可单独排列。然后粘贴整齐并将染色体编号，所编染色体号码填入表15。染色体的分类可以根据臂比的大小进行。臂比染色体类型代表符号1.0～1.7中部着丝粒染色体M1.7～3.0近中着丝粒染色体SM3.0～7.0近端着丝粒染色体ST7.0以上端部着丝粒染色体T带有随体、次缢痕或其它特征的染色体应在表中注明。如果进行了显带处理可同时将染色体带型填入表内。（8）翻折及绘图：将剪贴排列好的染色体组型图片进行拍照洗印。并且用坐标纸或绘图纸绘制出染色体组型模式图。如经显带处理时，可在模式图上标出染色体带型。最后将一张完整的染色体放大照片，一张翻拍的染色体组型照片和绘制的模式图贴在同一张绘图纸上，并在图的下面注明材料的名称、染色体总数（2n）、染色体组数和染色体基数。在对异源多倍体进行组型分析时，应注意根据亲本的组型分别排列。例如，普通小麦是异源六倍体，是由三个物种在系统发育过程中合成的。已知其染色体组为AABBDD，因此应按A组、B组、D组分别排列，而不是按照21对染色体的大小顺序排列。2．减数分裂时期的染色体组型分析：主要是利用性母细胞减数第一分裂粗线期的染色体。因为这一时期的染色体具有许多明显的形态特征。例如着丝粒、染色体、端粒，与核仁相连的核仁组织区，异染色质区等都能比较容易地观察到。并且这一时期同源染色体已经联会，原来的2n条染色体已经联会成n个二价体。所以对于染色体数目比较少，染色体较短的材料进行粗线期的染色体组型分析，能更好地研究染色体的形态特征。\n关于粗线期染色体组型分析的方法，除了取材和制片不同于有丝分裂组型分析以外（参见实验二），其它步骤同上。六、实验作业交染色体组型图（照片剪贴图和绘制的组型模式图）和染色体形态测量数据表。实验十二植物多倍体的诱发和鉴定一、实验目的通过实验，进一步了解人工诱导多倍体的原理，并初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的方法；学习对植物多倍体的细胞学鉴定和一般形态特征的观察。二、实验原理人工诱导多倍体的方法很多，可分为物理的（温度剧变、机械损伤、各种射线处理等）和化学的（各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等）方法。若诱发条件适应，可使植物分裂细胞内的纺锤丝形成受到抑制，而对染色体的复制无显著影响，使复制的染色体不能向两极分开，同时细胞也不能分裂成二个细胞，这样每个细胞内的染色体数增加了一倍或多倍，便形成了多倍体细胞，被加倍的细胞经一定时期后仍可恢复常态，继续分裂并保持了染色体的多倍性，并可在此基础上发育成多倍体植物。一般说来，多倍体植物的某些外部形态比正常未加倍植物有较明显的增大等现象。三、实验材料小麦（2n=6x）、大蒜（2n=2x）、西瓜（2n=2x、2n=3x、2n=4x）和玉米（2n=2x）植株；大蒜（2n=2x、2n=4x）、玉米（2n=2x、2n=4x）、西瓜（2n=2x、2n=3x）的根尖压片标本。四、实验用品显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、刀片、解剖针、广口瓶、镊子、烧杯、培养皿、载玻片、盖玻片、滤纸、纱布、酒精灯、量筒、温箱。五、实验药品卡诺氏固定液、浓盐酸、醋酸洋红（或地衣红）染色液、秋水仙碱1%母液、龙胆紫1%水溶液、70%酒精、0.1～0.2%升汞、蒸馏水等。六、实验方法与步骤1．诱发多倍体（1）处理种子：这种方法适用于发芽较快的植物，对不同种子视其不同生理特点，采用不同的处理措施。如麦类干种子，要先用福尔马林消毒或0.1～0.2%升汞溶液消毒10分钟（或用清水洗浸1～2天），再放入0.1%秋水仙碱溶液中浸24小时，取出后用清水洗净播种观察；而甜菜干种子，可用0.2～0.3%秋水仙素碱溶液浸泡72小时以上，取出种子冲洗干净，晾干并播种；对已萌动的种子处理，例如蚕豆，应将萌动种子放到0.05%秋水仙素碱溶液中，在25℃条件下浸24小时，洗净后播种或直接观察根尖。处理种子的培养皿，应铺有滤纸，以免种子流失。处理过程中必须保持药液的量，一般应加盖并注意添加药液。（2）处理幼苗①对于生长点暴露在外边的双子叶植物，可直接用适宜浓度的秋水仙碱溶液浸泡生长点。例如二倍体西瓜催芽，当胚根长到1～1.5cm时，将胚根倒置于存有0.2～0.4%秋水仙碱液的培养皿中，在25℃条件下，浸渍20～24小时，并用湿滤纸或纱布将根盖好，避免失水。处理后的幼苗，用清水冲洗残液后，进行栽种或砂培。②对生长点包藏的单子叶植物，必须在幼苗长出3～5片真叶（或分蘖盛期）时，把苗挖出，洗净根部，用刀片在幼茎距长根地方约1～2mm处切深2～3\n个叶鞘的伤口（若分蘖较大时也可浅切口），再浸入0.03～0.05%秋水仙碱药液内处理3～4天，处理时室温不要过高，并保持溶液的浓度。处理完毕，将幼苗冲洗数次，移栽温室内培育观察。（3）处理芽：处理成株的顶芽、腋芽的生长点时，一般采用将蘸有0.1～0.4%浓度的秋水仙素的棉球涂抹生长点，或将蘸有秋水仙素的棉球置放于生长点处，随时注意滴加清水保持药液浓度，1～2天后，拿掉棉球，反复冲洗生长点处的残存药液，待进一步生长后，进行观察和鉴定。有条件时，也可利用有性杂交获得实验材料，比如，同年种植西瓜的二倍体、四倍体和三倍体（二倍体×四倍体），这样即可观察植株性状，又可进行细胞学观察。（4）圆葱、大蒜材料的处理：将圆葱洗净后放入正好卡住圆葱的烧杯或培养皿中，使药液面接触圆葱根部，于25℃条件下培养3～5天，待幼根长0.5～1cm时即可取材固定，按有丝分裂制片方法进行制片。（5）注意事项①因秋水仙素属剧素药品，操作时严格注意，不能使药液接触皮肤、溅入眼内。②药品价格昂贵，一般应先配成1%母液，便于存放和使用。③每种处理都应设有对照，以便于观察分析。2．鉴定（1）细胞学鉴定：将已经加倍和未加倍（对照）的根尖、茎尖制成压片（方法同实验四），观察有丝分裂中期的染色体数（见示范片）。（2）形态鉴定：对西瓜的二倍体、三倍体和四倍体植株和玉米的二倍体、四倍体植株进行观察，分别比较鉴定二倍体和多倍体在形态上的主要差异。（3）气孔的鉴定：撕取西瓜叶子的下表皮组织，用龙胆紫染色1～2分钟，用水冲洗，用镊子将下表皮的正面置于载玻片上，加盖玻片，即成叶表皮细胞制片。也可用蒸馏水代替龙胆紫染色。①保卫细胞大小的测定：将叶表皮细胞的制片放在显微镜下，用目镜测微尺量气孔保卫细胞的长和宽（占目镜测微尺格数），然后从所测格数推算保卫细胞的实际长和宽度（以镜台测微尺校正目镜测微尺），校正时，使二种测微尺的“0”点重叠起来，计数二种测微尺正对的小格数，即可得出：重复10～20个气孔，算出保卫细胞长和宽的平均值。②单位面积上气孔数目的测定：将叶片表皮制片于显微镜下检视，计算每视野中气孔数，移动制片重复10次，求平均值（视野面积的计算，用目镜测微尺量视野直径，按公式S=πr2求算视野面积，得每平方毫米叶面积的气孔数）。③保卫细胞内叶绿体数目的测定：取叶下表皮于载玻片上，滴加0.1～0.2%硝酸银溶液数秒后，加盖玻片，在显微镜下观察保卫细胞内的叶绿体数目。七、实验作业1．将所测保卫细胞的大小和叶绿体数目及单位面积的气孔数列入表17。表17植物保卫细胞测定记载表植物名称倍数性保卫细胞每平方毫米气孔数染色体数长（μm）宽（μm）叶绿体数目玉米二倍体四倍体大蒜二倍体\n四倍体西瓜二倍体四倍体2．简述多倍体诱发的基本原理及意义。实验十三辐射对植物染色体的诱变作用一、实验目的通过对植物的辐射，了解物理因素对遗传物质的诱变作用。二、实验原理物理射线的电离辐射，具有非常短的波长以及相应的较大频率，其穿透力很大，在空气中γ－射线，射程可达几百米，速度为30万公里/秒。因此，对植物给予一定剂量的照射，很容易引起基因突变和染色体畸变，常见的有染色体粘着，着丝点区域断裂，破坏纺锤丝形成，染色体或染色单体的断裂等。在实际工作中，选择合适的剂量是很重要的。一般要求尽量减少对植物的生理损伤，提高遗传方面的效应，以有效地选择优良的变异类型和个体。三、实验材料小麦、大麦等植物种子。四、实验用品调湿调温箱、人工气候室、显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、刀片、镊子、解剖针、装有培养土的花盆。五、实验药品酒精、冰醋酸、洋红染料、蒸馏水等。六、实验方法与步骤1．有丝分裂中染色体畸变的观察：将小麦种子分别用1万伦琴、2万伦琴、3万伦琴照射后，连同对照在培养皿中发根，按根尖制片要求，进行有丝分裂的染色体观察。辐射处理常使染色体不易着色、粘连、聚结、断裂等，有时能观察到染色体和成对的染色体断片。2．不育性的观察：辐射种子在M1代生产不育的原因可能有染色体畸变、基因突变、细胞质突变和生理效应等。大多数人认为，染色体畸变是引起M1代不育的主要原因。其方法是把处理和对照组的种子，每组至少在100粒以上，分别种植在培养土中，待开花结实后进行统计，不育性的统计方法为全不育株在M1代中所占百分率或每一穗中结实小花的百分率。3．M2代辐射效应的观察：M1代的植株单株收取种子，稀播成株行，并在邻近播对照种，从出苗到开花结实直到成熟和对照种进行对比观察。在M2代生长过程中，除M1代的某些辐射效应还会出现外，将出现大量的分离，产生多种可遗传的变异如抗病与感病类型，早熟与晚熟类型，短秆型，矮化丛生，不育株与白化突变体等。这为育种工作开辟了一条有效的途径。七、实验作业1．绘制辐射处理后染色体发生畸变的有丝分裂制片的图象。2．简述辐射育种的原理和意义。实验十四植物DNA的提取与纯化\n一、实验目的掌握从高等植物组织中提取高分子量核DNA的方法，以提供用于建立高等植物基因文库所需要的DNA片段。二、实验原理高等植物含有坚硬的细胞壁，该壁是由纤维素和果胶质组成的，在液态氮存在的条件下，经研磨可以使之破碎。同时低温可以部分抑制DNA酶的活性，保护DNA不被酶解。破碎细胞含有细胞核及其它细胞器和细胞碎片。在4.9N（500gf）离心力的作用下可使细胞核沉淀，而其它细胞器和细胞碎片留在上清液中，使之细胞核与其它成分分离。分离后的细胞核在SDS的作用下，使核膜破裂，在蛋白酶k作用下使DNA与染色质蛋白解离，EDTA鳌合二价金属离子以抑制DNA酶的活性，用饱和酚和氯仿一异戊醇除去蛋白，以得到植物细胞核DNA的粗制品。粗制品除DNA外，还有一定数量的RNA及残存的少量蛋白、糖和色素，经CsCl密度梯度离心或电泳法回收，使DNA进一步纯化，用该法提取的DNA分子量大于50kb，可以用于DNA限制性内切酶消化。三、实验材料现采集的鲜嫩植物叶片或植物其它幼嫩组织。四、实验用品冷冻高速和超速离心机、水浴锅、紫外线分析灯、平板电泳槽、电泳仪、配液器、透析袋等。五、实验药品TE缓冲液、TAE缓冲液、0.8%低熔点琼脂糖、0.25%溴酚蓝、10mg/mlE·B（溴化乙锭）、研磨介质、核裂解缓冲液、饱和酚、氯仿一异戊醇、3MnaAc（醋酸钠）、无水乙醇、乙醚，氯化铯及液态氮等。有关试剂的配制方法见附录五。六、实验方法与步骤1．高等植物核DNA的快速提取：取鲜嫩的植物叶片10克，经液态氮速冻后用纱布包起砸碎，在液态氮中用研钵研磨成粉末。待粉末化冻后加于研磨介质（研磨介质/材料=体积/重量=1/1）研磨混均，用四层纱布过滤。滤渣再加研磨介质研磨，过滤，重复3次，后2次所加研磨介质液的量大约与每一次相等。这一过程需在冰浴中进行。合并的滤液，在离心力为4.9N（500gf）的条件下离心5分钟。收集沉淀，将沉淀加入核裂解缓冲液（核裂解液/材料=1/2）使之悬浮，在50℃水浴中保温1小时。用等体积饱和酚抽提一次，离心收集水相，水相再用饱和酚和氯仿－异戊醇（二者等体积）抽提一次，最后用氯仿－异戊醇抽提一次，水相加3MNaAc，使终浓度为0.3M，加2倍体冰冻乙醇沉淀DNA，置－20℃冰箱保存。2．植物核DNA进一步纯化（1）氯化铯梯度离心：将要进一步纯化的植物DNA溶于10毫TE缓冲液中，每毫升加1克固体氯化铯，最终浓度为1.558克/毫升，并小心倒转离心管使氯化铯溶解，然后加入200微升E·B液，混合均匀，用液状石蜡注满离心管，平衡后封口，在40000转/分的条件下离心44小时，取出离心管在紫外线灯下用注射器收集DNA区带。收集得到的DNA液加于等体积的异戊醇，振荡2分钟后离心，吸去上层有色液，如此反复进行3次，抽提掉E·B，得到无色透时的DNA溶液置于透析袋中，在TE缓冲液中透析24小时，期间更换3次透析液。透析后的DNA溶液加入3MNaAc,使终浓度为0.3M。加入2倍体积的冰冻乙醇沉淀DNA，置入－20℃冰箱保存。（2）低熔点琼脂电泳凝胶法：取适量的DNA\n样品加在低熔点凝胶（低溶点琼脂糖凝胶制作方法见附录五）加样槽中，加入为DNA样品体积1/3～1/4的0.25%溴酚蓝。在4℃的条件下电泳。待DNA样品明显移开点样槽（需紫外线灯下观察确定）后，在紫外灯下（以避开2600Å为好）切取含所需DNA片段的胶于小试管中，在65℃条件下保持5分钟使胶熔化，然后在已熔化的胶中加入等体积的饱和酚，轻轻上下倒置抽提15分钟，离心收集水相。再用饱和酚和氯仿联合抽提一次，最后用氯仿、乙醚各抽提一次。在水相中加入3MNaAc，使其终浓度为0.3M，加2倍体积的冰冻乙醇沉淀DNA，放于－20℃冰箱保存。七、实验作业1．植物核DNA粗提的关键步骤是什么？各步的作用机理是什么？2．氯化铯梯度离心应特别注意的问题是什么？3．低熔点凝胶纯化DNA应注意的问题是什么？为什么在确定回收DNA在胶上位置时要避免一定波长的紫外光？实验十五植物组织培养技术——烟草叶片的离体培养一、实验目的了解构建植物组织培养室所必须的设备及器材；熟悉并掌握植物组织培养的基本操作技术。二、实验原理植物组织培养（Planttissueculture）又叫植物的离体培养，是指通过无菌操作，把植物体的各类结构材料即外植体（Explant），接种于人工配制的培养基，在人工控制的环境条件下，进行离体繁殖或使其形成完整植株的技术与方法。植物细胞全能性学说是植物组织培养的理论基础。按外植体种类的不同可把植物组织培养区分为以下几类：1．植株培养：幼苗及较大的植株培养；2．胚胎培养及以胚胎为基础的培养技术，包括原胚和成熟胚培养，胚乳培养，胚珠或子房培养等；3．器官及器官原基培养，包括根、茎、叶、花器官及其原基的培养（含根、茎段和花药等）；4．组织培养，包括分生组织、形成层组织或其他组织结构（含愈伤组织）的培养；5．细胞培养，包括单细胞、多细胞或悬浮细胞和细胞的遗传转化体的培养；6．原生质体培养及其以原生质体为基础的培养技术，包括原生质体、原生质融合体和原生质体的遗传转化体的培养等。三、实验用品（一）仪器：高压灭菌锅，超净工作台，电子天平，微波炉、酒精灯、接种器械等。（二）化学试剂（见配制培养基）四、实验步骤（以烟草叶片培养为例）（一）培养基的制备1．母液的配制1）配制Ms大量元素母液（10×）1000mlNH4NO3（硝酸铵）16.50克KNO3（硝酸钾）19.00克KH2PO4（磷酸二氢钾）1.70克MgSO4·7H2O（硫酸镁）3.70克\nCaCl2·2H2O（氯化钙）4.40克2）配制Ms微量元素母液（100×）100mlMnSO4·4H2O（硫酸锰）223mgZnSO4·7H2O（硫酸锌）86mgH3BO4（硼酸）62mgKI（碘化钾）8.3mgNaMoO4·2H2O（钼酸钠）2.5mgCuSO4·5H2O（硫酸铜）0.25mgCoCl2·6H2O（氯化钴）0.25mg3）配制铁盐母液（100×）100ml称取FeSO4·7H2O278mg，Na2EDTA373mg分别溶于水，再混合定容至100ml。4）配制Ms有机物母液（100×）100ml甘氨酸20mg盐酸硫胺素（VB1）4mg盐酸吡哆醇（VB6）5mg肌醇1000mg5）常用激素母液的配制有些激素类不溶于水，配制母液时，需经加热或用少量稀酸、稀碱及95%的酒精溶解后再定容至所需浓度。萘乙酸（NAA）：先用热水或少量95%的酒精溶解，再加水定容；激动素（KT）和6—苄氨基嘌呤（6—BA）要先用1N盐酸溶解再用水定容；2,4—D先溶于1NNaOH再用水定容。2．培养基的配制1）根据实验要求，从母液中吸取所需量的大量元素（10×），微量元素（100×），铁盐（100×），有机物（100×）及植物激素放于烧杯中；称取蔗糖（30克/升）和琼脂（8克/L）加水至所需体积。2）加热使琼脂溶解。3）调pH值：用pH计或pH试纸测pH值，用0.1NNaOH或0.1NHCl调至pH为5.8。4）培养基分装入培养器皿中（三角瓶、试管、培养瓶等）3．培养基的灭菌120℃条件下在高压锅内灭菌20分钟。（二）外植体（烟草叶片）的接种培养1）从烟草幼苗取叶片。2）外植体表面消毒：0.42%次氯酸钠浸泡叶片6分钟，无菌水洗3~4遍。3）避开叶脉，把叶片切成1cm2小块，接种在Ms+5μMBA的不定芽诱导培养基上培养。4）26℃的温度条件下，每天光照16h培养3周后观察不定芽的生长情况。（三）不定根的诱导培养将不定芽从基部切下，转入Ms生根培养基中培养，3周后观察根的诱导率。五、作业1．试述植物组织培养室与常规实验室的区别。2．植物组织培培养的一般步骤与注意事项。3．分小组统计污染率，不定芽诱导率，不定根诱导率写出实验报告。