[农学]植物组织培养教案

[农学]植物组织培养教案

[重点难点]组织培养的概念、组织培养的类型、特点和应用第一节组织培养的概念一、组织培养的概念　是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。二、组织培养的特点：取材少生长周期短繁殖率高。人工控制条件管理方便三、培养的研究类型　组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等：第三节　组织培养应用及展望一、快速繁殖种苗组织培养的快速繁殖，就是应用组织培养和细胞培养技术，快速繁衍珍稀濒危植物。二、无病毒苗的培养三、在育种上的应用，。四、工厂化育苗参考文献1、颜昌敬编著植物组织培养手册1990.1上海科技出版社，2、朱建华主编植物组织培养实用技术2002.1中国升量出版社3、梅家训、丁习武主编组培快繁技术及其应用2003.4中国农业出版社4、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：2004.1中国农业大学出版社，[单元章节]第一章实验室及培养条件 [教学目的]基本掌基握组织培养实验室的设计；熟练掌握实验仪器设备使用和培养基用湿热灭菌方法以及无菌操作技术。[重点难点]37\n组织培养实验室的组成、常用仪使用；培养基用灭菌以及无菌操作技术；组织培养的条件。[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件；演示。[教学时数]2课时。[教学内容]第一节实验室及基本操作一、实验室（一）准备室(repairingroom)在准备室内要完成培养基制备、清洗与整理工作。为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：大型工作台、药品柜、普通冰箱、电子分析天平和托盘天平、电蒸馏水器、磁力搅拌器、电炉或电饭锅、酸度计、高压灭菌锅等。（二）接种室(transferingroom)1、对接种室要求2、接种室的主要设备及用具（三）培养室(culturingroom)培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养材料放在培养架上培养。培养条件:培养室一般保持在20-27℃左右，相对湿度以保持在70％-80％为好，一般需要每天光照10-16h。环境的相对湿度一般要求70％-80％的相对湿度。（四）炼苗室二、设备和器材（一）玻璃器皿（二）器械用具第二节基本操作一、洗涤（自学）二、灭菌(sterilization)灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体。　　37\n培养基用湿热灭菌方法三、无菌操作1、在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及紫外灯；2、接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋；3、上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；·4、先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍；5、接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；6、接种完毕后要清理干净工作台，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。本章小结实验室组成：准备室、无菌操作室、培养室、炼苗室；培养基用湿热灭菌；无菌操作无菌操作的技术程序。[自学指导与训练方案]讨论：建一个组织培养实验室起码需要用哪些设备和仪器。思考题：1、对接种室有哪些要求？如何对接种室消毒？2、培养室的作用是什么？对培养条件有什么要求？3、简述无菌操作步骤。4、简述培养基用湿热灭菌方法5、用95％酒精配成75％酒精1000ml,问用95％酒精和水各多少ml？参考文献1.刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社2、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，2004[单元章节]第二章培养基及其配制[教学目的]掌握培养基的种类和特点；基本掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；熟练掌握培养基的制备方法和步骤；初步掌握培养基的筛选方法。[重点难点]37\n培养基的种类和特点、培养基成分、作用和常用剂量；母液配制过程，利用母液配制工作培养基；培养基的选择。[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件。[教学时数]4课时[教学内容]第一节　培养基的种类和成分一、培养基的种类目前国际上流行的培养基有几十种，如：MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-8P培养基等二、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。1．水大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水；2、无机元素大量元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。微量元素Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。3．有机化合物(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖。(2)维生素(vitamin)主要有VB1、VD6、Vpp、VC、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。(3)肌醇又叫环己六醇。(4)氨基酸是有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用甘氨酸。4．植物激素(hormone)在培养基的各成分中植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。(1)生长素类(auxin)在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。生长素配制时可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶。(2)GA(37\n赤霉素)，赤霉素用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70％-100％失效。(3)细胞分裂素类(cytokinin)包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、n(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。细胞分裂素作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，当组织内细胞分裂素／生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。5.培养材料的支持物琼脂(agar)在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶，溶解于90℃以上的热水。6．抗生物质抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mg／L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，7．活性炭可以吸附外植体产生的致死性褐化物；一般为0.1％-0．2％。三、培养基的选择（一）单因子试验。各项条件和因素都维持在一般水平上，只变动一个因子，以找出这一因子对试验影响和影响的程度。（二）多因子试验。（三）逐步添加和逐步排除的试验方法（四）广谱试验法第二节、培养基的制备母液的配制和保存　称量　溶解　定容　分装　标签　保存。母液种类成分规定用量(mg/L)扩大倍数称取量(mg)母液定容体积(ml)配1LMS培养基吸取量(ml)大量元素KNO3NH4NO3MgSO4.7H2OKH2PO4CaCI.2H2O1900165037017044020380003300074003400880010050微量元素MnSO4.4H2OZnSO47H2O22.38.6223086037\nH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCI2.6H2O6.20.830.250.0250.02510062083252.52.5100010铁盐Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.327.810037302780100010有机物烟酸甘氨酸VBVB肌醇0．52．00．10．51005025100525500050010 [自学指导与训练方案]复习思考题：1、培养基的种类及特点有哪些？2、培养基一般包括哪些基本成分？如何配制？3、如何选择合适的培养基？4、用于植物组织培养的植物生长调节物质主要有哪两种？它们在组织培养中各起什么作用？作业：1、MS培养基配制过程。2、75%乙醇的配制3、BA和NAA的配制。自学指导：培养基的选择试验。参考文献1、颜昌敬.植物组织培养手册.上海：上海科技出版社，19902、谭文澄.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，20003、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，2004[单元章节]37\n第三章外植体的选择与灭菌方法[教学目的]熟练掌握组织培养相关的灭菌方法，无菌操作技术和外植体的选择与灭菌的方法步骤，掌握污染原因及采取的对策。[重点难点]消毒概念灭菌方法无菌操作污染　[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件，　[教学时数]2课时。[教学内容]一　外植体的选择　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（一）外植体的部位　（二）取材季节对大多数植物，应在其生长开始的季节。（三）器官的生理特点和发育幼年组织比老年组织具有较高的行态发生能力。　（四）外植体的大小茎段长0.5cm，叶片面积5mm2。二、外植体的消毒方法（一）常用消毒剂常用的有0.1%升汞溶液。70-75%酒精。（二）外植体的灭菌方法　1、茎段，茎尖及叶片的消毒2、果实和种子的消毒3、根及地下部器官的消毒4、花药的消毒　　　　　　　　　　　　植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。首先，把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，洗时可加入洗衣粉清洗。第二步要在超净台用70%-75%酒精浸10-30s。第三步是用灭菌剂0.1%升汞处理5-10min。升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；37\n第四步用无菌水涮洗4-6次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。三、污染的原因及对策　　　　　　　　　　　　污染指：组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌导致培养失败现象。1、污染的原因外植体带菌，培养基灭菌不彻底，操作员不遵守操作规程等。（1）细菌污染在接种后1-2天可发现，菌斑呈粘液状。（2）真菌污染在接种3天后可发现，污染部分长有不同颜色的霉菌。2、污染的预防措施（1）将取的枝条用水冲干净后插入自来水中使其抽枝，用新抽的枝作外植体。（2）晴天中午到下午采样（3）培养基加抗生素（4）操作人员严格遵守操作规程接种（5）培养基及其用具灭菌要彻底四、培养条件大多数植物组织培养都是在23-27℃之间进行，一般采用25土2℃。光照强度一般为1000—6000LX。最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。容器内湿度一般100%，环境的相对湿度一般要求70％-80％的相对湿度。培养基pH值大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8。[自学指导与训练方案]复习思考题：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1、灭菌和消毒有何区别？　　　2、常用的灭菌方法有哪几种？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3、接种材料如何进行消毒处理？　　　　　　　　　　　　　　　　　　5、组织培养中如何尽量避免出现污染？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6、植物组织培养技术主要包括哪些环节？各环节的主要工作内容是什么？训练：1、不同消毒剂消毒剂处理效果试验。2、污染情况调查。参考文献37\n1、谭文澄.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，20002、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，20043、刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社[单元章节]第四章植物组织培养的基本原理[教学目的]在了解组织培养基本原理的基础上，掌握植物细胞的全能性、器官的发生、愈伤组织培养等[重点难点]植物细胞的全能性、细胞分化、脱分化、再分化、愈伤组织培养、体细胞胚[教学方法]启发式；讲授；现场教学。[教学时数]4课时。[教学内容]第一节植物细胞的全能性细胞分化一、植物细胞的全能性（totipotent)：植物每个细胞都携带一套完整的基因组（该植物体全部遗传信息），在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。二、细胞分化细胞分化指：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。（一）细胞分化分为行态结构分化和生理生化分化（二）发育中的植物不存在部分基因组永久关闭情况。即保持潜在全能性，只要条件适合便表现出全能性。（三）在完整植株中，细胞发育途径一旦被决定，通常不易改变，但离体培养通过脱分化可改变。（四）极性与分化关系密切，极性是细胞分化前提，极性是指：细胞（也可指器官、植株）内的一端与另一端在形态结构和生理生化上存在差异现象。37\n（五）生理隔离。（六）细胞分裂对细胞分化有重要作用。（七）激素对细胞分化有重要调节作用。（八）细胞核染色体和DNA变化对细胞分化重要作用。三、组织分化在细胞分化的基础上，可以分化出各种各样的组织（分生组织、保护组织、机械组织输导组织等）。是形成不定芽和不定根的基础。器官分化主要指根和芽的分化。第二节离体条件下植物器官的发生一、外植体脱分化（去分化）脱分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物组织或器官失去原来结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞。再分化（redifferentiation):经脱分化的愈伤组织在一定的培养条件下长出植株的能力。1、细胞水平再分化：细胞壁变厚、假导管细胞形成、酶水平变化等。形成各种细胞。2、组织水平的再分化；维管组织分化，形成愈伤组织（由高度液泡化的细胞组成）愈伤组织含有拟分生组织或瘤状结构。3、器官细胞水平的再分化（器官发生）：再分化形成各种器官4、植株再生途径器官发生途经就是先诱导获得不定芽或不定根，然后获得再生植株；体细胞胚发生是指由愈伤组织或外植体形成体细胞胚，然后通过体细胞胚而发育成再生植株；原球茎发生是兰花离体培养中特有的植株再生；愈伤组织发生是由愈伤组织经再分化而发育成再生植株。二、愈伤组织的培养（一）愈伤组织的形成、生长、保持1、愈伤组织的形成：外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。2、愈伤组织的生长37\n3、愈伤组织继代培养（二）愈伤组织的形态发生方式从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式：1、不定芽方式（unfixedbud）指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。2、胚状体方式（somaticembryo）指由培养细胞诱导分化出的胚胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株第三节植物体细胞胚发生胚状体亦称体细胞胚；指在植物组织培养过成中，由植物体细胞所形成的类似于合子胚的结构。具有根、茎结构，能一次性形成再生植株。胚状体发生：指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。一、植物体细胞胚状体发生过程（一）体细胞胚状体发生过程由外植体经胚状体形成完整植株可分：五个时期：原胚期、球形胚期、心形胚期鱼雷形胚期、子叶期（成熟胚）、发育成完整植株（二）胚性和非胚性或愈伤组织生理形态差异1、胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）：表面松脆、细胞小，这种小细胞聚集为丛状，被称为EC。DNA、RNA及蛋白质合成活跃，再生力强。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大，大液泡的细胞。（三）体细胞胚发生的基因表达机理二、植物体细胞胚发生途径（一）体细胞胚发生方式：体细胞胚发生途径：直接途径、间接途径（二）体细胞胚（Somaticembyo）的来源：外植体细胞经脱分化后直接产生体胚，多数起源于单细胞三、植物体细胞胚发生的双极性和生理隔离双极性是指：细胞发育初期，其内含物分布具不均匀性，而形成体细胞后，具有发育成芽端和根端的潜在能力。（一）植物体细胞胚发生的极性37\n（二）植物体细胞胚发生的生理隔离生理隔离：早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝，随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞（维管束系统无直接联系），为孤立状态。生理隔离是体细胞胚发生的先决条件。四、体细胞胚胎发生的生理学和生物化学（一）蛋白质和核酸（二）多胺代谢（三）糖类、金属离子和微量元素（自学）（四）内源激素1、生长素2、细胞分裂素3、赤霉素4、脱落酸（自学）（五）活性酶（自学）第三节影响植物离体形态发生的因素一、植物种类和基因型：胡萝卜易诱导体细胞胚，烟草难。二、培养材料的生理状态1、植株发育年龄：幼嫰组织比老态组织具有较高的体形态发生力，特别生根能力。2、培养器官或组织类型：3、培养时间和细胞倍数：培养时间越长或继代次数越多，会推迟或降低形态发生能力。三、培养基1、植物营养：2、物理性质3、植物生长调节物质：生长素、细胞分裂素、赤霉素四、培养条件（一）光照：一般来说光照强度为1000---5000LX，最常用每日是10--16h的光照。（二）温度：大多数植物组织培养都是在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。[自学指导与训练方案]思考题：1、植物细胞的全能性概念。2、什么是植物细胞分化、脱分化、再分化？3、愈伤组织是如何形成的？4、植物离体培养中再生植株的主要途有哪些？5、简述愈伤组织细胞分化。37\n6、简述体细胞胚状体发生过成。7、影响植体离体形态发生的因素有哪些？参考文献1、孙敬三，桂耀林主编．植物细胞工程实验技术．北京：科学出版社，19952、周维燕主编．植物细胞工程原理与技术．北京：中国农业大学出版社，20013、刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社4、奚元龄等．植物细胞培养手册．北京：农业出版社，1992．278～2975、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，2004[单元章节]第五章植物器官和组织培养[教学目的]掌握植物器官和组织培养的主要技术，特别是茎段、叶片、愈伤组织培养技术的应用。[重点难点]茎节和切段、叶片、花器官、愈伤组织培养[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件[教学时数]2课时。[教学内容]第一节植物器官和组织培养的基本程序器官培养指：以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养。一、无菌外植体的获得1、外植体：如根的根尖，茎尖，茎节，叶片，花蕾，果实、块茎、鳞茎、种子等2、灭菌（以上讲过）。二、初代培养物的建立采来的植物材料经过灭菌处理得到无菌外植体--初代培养，是在无菌条件下经无菌操作而获得。三、形态发生和植株再生37\n形态发生途径；器官发生、体细胞胚胎发生。器官发生中芽多发生在愈伤组织的表层，即外起源。而根发生在愈伤组织的深处，即内起源。体细胞胚胎起源于单细胞，体细胞胚具有双极性。四、培养产物的观察记载（一）愈伤组织、外植体愈伤组织诱导率、愈伤组织生长量。（二）体细胞胚、胚状体诱导率。（三）芽分化诱导率。第二节植物营养器官培养一、离体根的培养以植物根切段为外植体进行的离体培养技术．离体根培养是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系．（一）根无性系的建立将种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发，待根伸长后从根尖一端切取长1cm的根尖，接种于培养基中。1、根直接增殖：养基如MS也可采用，但必须将其浓度稀释到2／3或1／2，25－27℃黑暗条件培养，使根直接增殖。2、根间接增殖；根--愈伤组织---芽或根。1、根形成过程：以不定根方式进行。（二）影响离体根发生和生长的因素培养基、激素、加适当浓度生长素有利根生长，赤霉素能增加侧根发生与生长。植物材料：一般用种子在无菌条件下萌发根尖。光照和温度：25-27℃黑暗条件培养有利。二、植物茎培养植物茎培养又分为茎尖和茎段培养茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织（茎尖）0.1mm部分进行无菌培养，应用于无病毒苗培育。茎段培养：对带有腋芽或叶柄的茎段进行无菌培养。37\n茎段培养优点：是以芽生芽方式繁殖，易培养成功，变异小，性状均一，繁殖速度快，故作快速繁殖的主要外植体．茎段培养中可能出现四种情况：单芽、丛生苗、完整植株、愈伤组织。　三、离体叶的培养离体叶培养指；以植物叶器官为外植体进行的离体培养技术．（叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养）。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。(1)材料选择及灭菌(2)接种把灭菌过的叶组织切成约0．5cm见方小块或薄片(如叶柄和子叶)，接种在MS或其他培养基上，培养基中附加BA和NAA。（3)培养叶接种后培养条件为每天10-12h光照，光强1500-30001x。培养约2周至4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。这时应转移到再分化培养基上进行分化培养。第三节植物繁殖器官培养一、花器官的培养花器官培养指整朵花或其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。其培养方法如下：取材从健壮植株上取未开放的花蕾作外植体材料。经消毒、接种培养。要加入生长激素和细胞分裂素，诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株。一、种子培养种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。培养技术如下：（1)种子灭菌种皮厚或不饱满的种子，宜用0．1％升汞消毒10-20min。应先用75％酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。(2)培养基对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般1％-3％。(3)接种培养种子培养的接种较容易，把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列，放在20-28℃的条件下培养，1000-20001x光强，每天光照10h。第四节植物组织培养组织培养：指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层，胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。一、分生组织培养37\n分生组织培养指对分生组织进行离体培养，包括根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。茎尖的培养；茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。微茎尖和普通茎尖培养。茎尖培养步骤如下:(1)取材挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。(2)消毒接种(3)接种为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为0．5cm左右大小。这样取茎尖大小只能作为快速繁殖。为脱病毒：在剖取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，用解剖针或解剖刀片将分生组织切下来（0.2－0.5mm），可带1~2枚叶原基。茎尖培养后可能出现四种情况：芽萌发、产生胚状体、产生不定器官、产生愈伤组织。二、愈伤组织培养愈伤组织培养：指诱导植物外植体产生无序生长的薄壁细胞及其培养技术。通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株．三、植物薄层组织培养植物薄层组织培养：指植物薄细胞层组织进行离体培养的技术。薄层细胞培养采用茎表皮层细胞做外植体，进行平板培养。该种培养技术具有取材方便，表面消毒方便，不通过愈伤阶段直接分化成芽、根等优点。[自学指导与训练方案]复习思考题：1、植物器官和组织培养的基本程序是什么？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2、什么是茎尖、叶培养？　　　3、茎尖、茎段、叶培养的方法和步骤？　4、什么是植物薄层组织培养？6、茎段培养的目的是什么？参考书：1、梅家训、丁习武主编组培快繁技术及其应用2003.4中国农业出版社2、高新一、王玉英编著植物无性繁殖实用技术2003.12金盾出版社3、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：2004部中国农业大学出版社，37\n[单元章节]第六章植物胚胎培养及离体授粉[教学目的]在了解胚胎培养意义基础上，明确胚胎培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养的方法、离体授粉的方法。[重点难点]胚胎培养及离体授粉的概念、培养方法[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件，演示。[教学时数]2课时。[教学内容]•胚胎培养（embryoculture）植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。第一节　植物胚培养一、胚培养的类型:胚培养的类型：幼胚培养、成熟胚培养。在未成熟胚胎的培养中常见有三种明显不同的生长方式，一种是继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；另一种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为“早熟萌发”；第三种是在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。二、幼胚培养方法苹果幼胚培养（1）幼胚培养一般在授粉后30~50d内取幼果，因这时种子内的胚已开始发育，较易培养成功。成熟胚培养取自处于成熟期果实的种子。胚培养的材料进行表面消毒。（2）切开果实取出种子，切开子房壁取出胚珠，剥离珠被取出胚，接种在BA0.25+IAA0.5的1/2MS培养基上。培养条件为25－30℃和1500－2000lx光照14h。37\n（3）分化增值时，把苗切段移植到加有BA0.5－1.0和CH300的1/2MS培养基上，在光下培养，可使绿苗得到增殖和生长。（4）苗的生根和移栽，三、成熟胚培养成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。培养基用MS，适合于幼胚培养的糖为8%-12%，适合于成熟胚培养的糖为2%。加一些天然胚乳（椰乳）对胚培养有促进作用。多数植物幼胚培养温度25-30℃。光照：黑暗或弱光。第二节　植物胚乳培养植物胚乳培养：将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株。一、植物胚乳培养方法取授粉4-8d后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.5-2.0mg/L，BAO.1-1.Omg／L。在25-27℃和黑暗条件或散射光下培养，约6-lOd胚乳开始膨大，再培养形成愈伤组织．这时应转到分化培养基上培养，分化培养基可加入0.5—3.0mg／L的BA及少量的NAA。二、影响因素：培养基、培养温度、光照　第三节　植物胚珠和子房培养一、胚珠的培养胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取出胚珠置于培养基培养的过程。对胚珠进行培养时，首先从花中取出子房进行表面消毒，然后在无菌的条件下进行解剖，取出胚珠，放在培养基上进行培养，基本培养基一般均用Nistch培养基，如MS、N6、B5等培养基也可采用。将胚珠培养成植株的关键是选择胚的发育时期，实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。37\n二、子房培养子房培养指将子房从母体分离下来置于培养基上,使其进一步发育成幼苗的技术。子房培养意义:胚珠培养时分离胚珠困难,用子房培养，使未受精胚囊中单倍性细胞诱导发育成单倍植株；获得杂种植株,在二个有性不亲和物种杂交中,利用子房培养的方法可获得杂种植株；为试管受精提供一项技术。(一）培养方法子房培养方法与胚珠的培养相似，如培养未受精的，用开花前1-5天的子房。消毒方法见78页。用MS、B5等培养基。由于子房存在性细胞和体细胞，都能产生愈伤组织，进一步发育成植株，所以，植株有来源于性细胞的、有来源于体细胞。来源于性细胞的是单倍体，有来源于体细胞的是二倍体。（二）影响因素用MS、N6、B5等培养基，加激素，大麦子房培养加2，4—D0.5+NAA1.0+KT1.0。第三节　植物离体授粉植物离体授粉指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来,进行无菌培养,并用一定的方式授无菌花粉,在试管内实现受精技术。（一）离体柱头授粉离体柱头授粉指通过雄蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子的技术。离体柱头授粉方法是在花药未开裂时取母体花蕾，消毒后，在无菌条件下，将整个雄蕊接种到培养基上，当天或第二天，在其柱头上授以无菌花粉。（二）离体子房授粉离体子房授粉指通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行授精，最后获得种子的技术。1、活体子房内授粉：活体植株上的子房用花粉悬浮液授粉，使子房发育并形成种子。操作步骤：将母本花蕾去雌并套袋，采父本花粉，母本花蕾去雌后1-2天将父本花粉引入子房。直接引入法：将子房顶端开一小口将花粉引入子房；注射法：用100mg/L硼酸将花粉制成悬浮液用注射器注入子房．37\n2、离体子房内授粉：指将无菌花粉对离体培养的子房进行授粉，最后获得种子的技术。在花药未开裂时取母体花蕾，消毒后，在无菌条件下，将整个雄蕊接种到培养基上，当天或第二天，将子房顶端开一小口将花粉，将花粉引入子房（三）离体胚珠授粉离体胚珠授粉指离体培养未受精的胚珠上授粉,最后在试管内获得种子的技术。离体子房和胚珠授粉是将花粉直接授于子房或胚珠，克服了柱头和花柱组织造成不亲和性的障碍，又克服了活体子房的脱落。二、离体授粉的方法授粉程序：确定开花时间、制备无菌子房或胚珠授、制备无菌花粉、子房或胚珠试管内授粉。将母本花蕾开花前去雌并套袋，开花后1-2天将花蕾取下，经消毒后，剥去子房壁使胚珠外露，进行无菌培养。在花药未开裂时取母体花蕾，消毒后，在无菌条件下，将整个花药接种到培养基上，当花粉散出时，将花粉授于胚珠。三、影响离体授粉受精的因素（一）外植体1、柱头和花柱：有的必须去掉柱头和花柱，有的不必去掉。2、胎座：胚珠或子房带有胎座，有利于离体授粉受精成功。3、外植体的生理状态：多数开花后1-2天剥离的胚珠结实率高。可以把剥离的胚珠的时间选择在雄蕊授粉后和花粉管进入子房之前。（二）培养基等MS、White、Nitsch等，糖4－7%，温度20-250C,黑暗或弱光[自学指导与训练方案]复习思考题：1、什么是植物胚胎培养、植物胚乳培养、胚珠和子房培养？2、什么是植物离体授粉、离体柱头授粉、离体胚珠授粉？3、简述离体授粉的程序。参考书：1、刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社2、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，2004[单元章节]第七章花药和花粉培养37\n[教学目的]掌握花药和花粉的区别，掌握花药最佳接种时期、花药培养的大致过程；基本掌握花药培养的发育途径；初步掌握花药和花粉培养的意义及花粉培养的过程[重点难点]花药材料消毒和接种，花粉的分离，花粉培养方法，花粉发育过程[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件[教学时数]2课时。[教学内容]第一节花药和花粉培养的意义一、花药和花粉培养的概念花药和花粉培养是指：花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株。花药培养属器官培养，花粉培养属细胞培养，但花药培养和花粉培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。二、花药和花粉培养的应用（一）育种方面由于花粉是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株，经染色体加倍而成为正常结实纯合二倍体植株。缩短育种年限。（二）物种进化研究：利用单倍体材料可查明其原始亲本染色体组的构成。（三）遗传分析：单倍体是研究基因性质及其作用的良好材料。（四）分子生物学（五）植物基因克隆筛选第二节　　花粉小孢子发育途径把花粉形成植株的途径叫“花粉孢子体发育途径”。把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称“雄性发育”。37\n一、花粉发育时期：适宜的花粉发育时期　被子植物花粉发育为四个时期：四孢子期、单核期（小孢子期）、二核期、三核期（雄配子期）。二、花药材料的选择：花药培养大多数是单核期三、培养基的选择　花药培养所采用的培养基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2，4-D，NAA和IAA等。诱导愈伤组织的培养基可添加2，4-D，其浓度为1~3mg／L，分化培养基可添加2~3mg／L的BA，再加少许的IAA(0.2~0.5mg／L)。花药培养在某些情况下，可不经愈伤组织阶段，直接产生胚状体。但多数情况下是产生愈伤组织，这时尚需要进一步转移到分化培养基中，诱导分化产生芽。四、消毒接种培养　　从健壮无病植株中采集花蕾，先用70％的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸10-20min，或用0．1％升汞液消毒7-lOmin，然后用无菌水洗3-5次。　　花药在消毒前，也可进行预处理，将花蕾剪下放入水中，在冰箱4-5、下保持3-4d。低温贮藏后，花药容易发生胚状组织。接种时把花蕾用解剖刀、镊子小心剥开花蕾，取出花药，注意去掉花丝，然后散落接种到培养基上。第三节花粉的培养　花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。一、花粉的分离　　取新鲜未开的花蕾经低温处理，然后消毒，将花药放到加有基本培养基的小烧杯中，用注射器的内管在烧杯的壁上挤压花药，使花粉从花药中释放出来。用尼龙筛过滤掉药壁组滤液再经低速离心(100-160r／min)，上面的碎片可用吸管吸掉，再加入新鲜培养基。连续进行两次过滤，到每毫升含103~104个花粉的浓度就可以了。　　简单的方法是花粉从花药中挤出后，用镊子取出花粉空壳，放在培养基上培养。此法适于微室栽培，但往往有药壁等体细胞混入。二、培养基成分培养基选用Nitsch作基本培养基，含有诸如硝酸钙、硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰子胚乳等。三、花粉培养方法37\n１、平板培养2、液体培养3、双层培养4、看护培养法5、微室培养法四、移栽训化，保持湿度80％－90％，弱光五、白化苗现象（一）白化苗特征（二）白化苗的发生（三）白化苗的控制第四节单倍体植株鉴定和染色体数目加倍一、花粉和花药植株的倍性花粉和花药植株的倍性鉴定二、花粉和花药植株的染色体加倍化学试剂诱变：人工诱导多倍体在育种上的应用：花药离体培养法秋水仙素处理单倍体植株染色体数目加倍的纯合体[自学指导与训练方案]复习思考题：(1)花药培养和花粉培养有何区别?(2)花药培养时选择什么发育时期的花药?为什么?(3)花药培养时培养基配制有什么特点?(4)花粉培养时怎样使用微室培养和看护培养。（5）单倍体植株的加倍。讨论：花药培养与单倍体育种的前景如何？参考书：1、刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社2、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，2004[单元章节]第八章植物细胞培养[教学目的]了解植物细胞培养的方法及培养条件基础上。明确单细胞的分离和培养方法37\n[重点难点]单细胞分离，悬浮培养，单细胞培养方法[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件[教学时数]2课时。[教学内容]第一节植物细胞培养细胞培养：指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞(或花粉细胞，卵细胞）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术一、植物细胞培养（一）单细胞分离的方法1、机械法：将叶片撕去表皮，在研钵中加10g叶片和40ml研磨介质（20μmoI/L　蔗糖＋10μmoI/LMgCI2+20μmoI/LTris－HCl缓冲液，pH7.8),轻研磨后用沙布过滤,,滤液经过低速离心,游离细胞会沉降到试管低部，得到纯化细胞。2、酶解法：利用果胶酶处理，植物叶片使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。3、由愈伤组织分离单细胞：A、将未分化、易散碎的愈伤组织转移到装有适当液体培养基的三角瓶中，然后将三角瓶置于水平摇床上以80-100r/min进行震荡培养，获得悬浮细胞液。B、用孔径约200μm的无菌网筛过滤，以去除大块细胞团；再以400r/min速度离心，除去比单细胞小的残渣碎片，获得纯净的细胞悬浮液。（二）单细胞培养单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，在通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，甚至长成完整植株的技术。1、平板培养2、看护培养3、微室培养法4、条件培养基培养二、植物细胞的悬浮培养悬浮培养是指：将游离的植物细胞按一定细胞密度，悬浮在液体培养中进行培养方法。（一）悬浮培养方法：分批培养、半连续培养、连续培养。（二）悬浮细胞的继代：悬浮细胞培养应定期做继代培养，最适合的周期为1-2周37\n（三）培养细胞的同步化：同步培养是指在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期（G1、S、G2和M）的各个阶段。同步性的程度以同步百分数表示。（四）培养基的振荡：培养基的振荡目的是为改善液体培养基中培养物的通气状况。三、培养细胞蛋白质和DAN含量的变化胚性愈伤组织中蛋白质含量和合成速率高于非胚性愈伤组织。胚性愈伤组织中RNA合成速率高于非胚性愈伤组织。随着体细胞胚发育，DNA合成量也明显增多。四、影响细胞培养的因素（一）培养基：N6、MS、B5培养基适合于单子叶植物细胞进行悬浮培养，NS、B5、LS、SL等培养基适合于双子叶植物细胞进行悬浮培养。（二）细胞密度：指单位体积内细胞数目，以每毫升培养液中含多少个细胞表示。悬浮培养最低有效密度一般为0.5×105---1.0×105个/ml。（三）生长调节剂：2，4－D特别利于薄壁细胞生长，所以悬浮培养时常加入2，4-D。细胞分裂素诱导细胞分裂，使细胞数量增多，量适当。（四）pH和CO2浓度：悬浮培养液缓冲能力弱，pH变化大，常用甘露醇（03－0.6moI/L)调节渗透压、用添加椰子乳（10%）或聚乙稀吡咯烷酮（PVP，1%）来缓冲酸碱度变化。第二节　植物生长和活力的测定一、细胞生长的测定二、活力的测定第三节　植物细胞培养的应用1、细胞培养产生次生代谢产物（药品、香料、染料、糖类等）。2、是细胞生物学研究方面的一项重要技术。3、为细胞融合于细胞于细胞杂交创造条件，可产出新品种。4、为基因转移创造条件。5、筛选突变体（体细胞无性系变异）。第四节人工种子概念：“通过植物组织培养的方法获得发育完全的胚状体，并且将其用适当的方法保存起来形成类似天然种子的结构”。37\n用人工种皮包被体细胞胚，可以制造人工种子，人工种皮：藻酸钠，解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题，人工胚乳用营养物质、糖、激素、杀虫剂、等。[自学指导与训练方案]讨论：单细胞培养目的和意义参考书：1、刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社2、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：中国农业大学出版社，2004[单元章节]第九章植物原生质体的培养及细胞融合[教学目的]初步掌握原生质体培养的意义；掌握原生质体的分离方法，掌握原生质体培养方法，基本掌握原生质体融合的方法。　　　　　　　　[重点难点]原生质体分离，原生质体培养，原生质体融合　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件[教学时数]2课时。[教学内容]第一节原生质体分离原理：植物原生质体就是除去了细胞壁的一个为质膜所包围的的裸露细胞。构成细胞壁的重要成分是纤维素和果胶等物质，因此采用相应的酶降解法可脱去细胞壁产生具有活力的原生质体，其在合适的离体培养条件下具有繁殖，分化，再生成为完整植株的能力。一、原生质体分离 （一）植物材料　1、细胞悬浮培养物　2、叶肉细胞3、植物材料的预处理　　　　　　　　（二）酶1、酶的种类　2、渗透稳定3、酶溶液的PH值　　　　　　　　　　　　　　　　（三）原生质体分离（四）影响原生质体分离的因素二、原生质体的纯化37\n分离在的原生质体中，常常混杂有细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以纯化原生质体。1)沉降法、2)漂浮法、3)不连续梯度离心法三、原生质体活力测定1、FDA法2、伊凡蓝法3、酚藏花红染色法4、目测法一、影响原生质体数量和活力的因素（一）分离材料的生理状态（二）酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压（三）分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间（四）环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响第二节、原生质体培养方法一、原生质体培养方法（一）平板培养（二）液体浅层培养（三）液体－固体双层培养二、影响原生质体培养的主要因素（一）原生质体活力（二）基因型（三）起始培养密度（四）渗透压稳定剂（五）培养基成分（六）培养条件三、原生质体再生(一)细胞壁再生1、细胞壁再生：原生质体培养后1-2天可合成完整的细胞壁。2、影响细胞壁再生的主要因素：基因型、供体细胞分化状况、培养基的成分3、再生细胞壁的鍳定：荧光染色法。第三节原生质体培养37\n一、原生质体培养方法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　二、影响原生质体培养的因素1、培养基成分2、渗透稳定3、无机盐　4有机成分5、激素6、PH值　7、原生质体密度的影响　　　　　　　　　　　　　第四节　植物体细胞融合用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法一、原生质体融合由于体外培养的细胞很少会发生自发融合，因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。（一）原生质体融合原理带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。邻近原生质体之间紧密接触。在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合。使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的化合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为在Ca2+-高PH液的处理下,Ca2+和质膜结合的PEG分子被洗脱,导致电荷重新分配,使原生质体的一些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷连接,由此引起融合。电融合（electrofusiontechnique)法电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，是融合率大为提高。融合过程的分子机制：是以电降解及双向电泳的联合作用为基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。(二)细胞融合类型和方法1、细胞融合类型（1）对称融合：使种内或种间原生质体融合时，产生核与核、胞质与胞质间重组的对称杂种的技术（双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息）。亲缘关系较远的种、属间植物对称融合后，而产生不对称杂种。（2）不对称融合：通父母本在后代中贡献不同，射线处理，化学处理37\n（3）微原生质体融合(微核技术):细胞经微核化处理后,形成外包有被膜,内有染色体的微核为供体,与受体原生质体融合,使部分基因转移的技术.2、原生质体融合方法（1）化学融合剂促进细胞融合（2）电处理融合法（三）融合体的培养和发育１、融合产物类型2、融合体的发育过程：细胞壁再生、核融合　、细胞增殖：二、体细胞杂种选择原生质体融合后产生同核体、异核体、没有融合的原生质体。（一）杂种细胞的筛选1、互补筛选法2、机械筛选法（二）杂种植株的选择杂种植株的再生与鉴定 杂种植株的再生是指从愈伤组织培养出杂种植株的过程。[自学指导与训练方案]复习思考题：1、原生质体培养有何意义？　2、如何分离原生质体？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3、影响原生质体培养的因素有哪些？　4、原生质体融合方式及过程如何？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5、原生质体培养过程中的发育途径如何？　　　　　　　　　　参考书：1、刘庆昌吴国良植物细胞组织培养2005.3中国农业大学出版社[单元章节]第十章植物离体繁殖[教学目的]掌握快速繁殖过程、试管苗的移栽、污染的预防措施，了解经营思路、成本核算，学会制定生产计划。[重点难点]试管苗增殖率的估算、生产计划制定、工厂化生产的工艺流程、成本核算。37\n[教学方法]启发式；讲授；[教学时数]2课时。[教学内容]概念：所谓离体繁殖，就是利用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织在人工控制的适宜条件下，迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。第一节植物快繁的器官形成方式一、短枝发生型外植体是带叶茎段，培养萌发，形成完整植株，再剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。又称微体扦插。二、丛生芽发生型（顶芽和腋芽的发育）指顶芽和腋芽的发育在适宜条件下，不断发生腋芽而呈丛生状芽。三、不定芽发生型不定芽方式（unfixedbud）指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。四、胚状体发生型胚状体方式(somaticembryo)指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。五、原球茎发生型兰花茎尖或腋芽接种后1~2个月培养的茎尖即可形成原球茎球状体，以后即发芽生根长叶。第二节快速繁殖过程快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的移植。一、无菌培养物的建立1．外植体的选择2、外植体的灭菌3、初代培养二、芽的诱导及扩大化繁殖（增殖）继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。37\n继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节三、根的诱导当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。生根培养可采用1／2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA)。糖用20g/L四、试管苗移栽驯化试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。第三节影响快繁的因素一、外植体：来源、生理年龄、大小。茎尖临界大小为携带1-2个叶原基，为0.2-0.3mm。二、培养基：ＭＳ用的最多。蔗糖为好，浓渡2－4％，生产上用白糖。一般是高浓度的细胞分裂素和低浓度的生长素配合。三、培养条件：光照1000－3000LX，生根3000－10000LX，每天光照14－16h,黑暗8－10h。温度：250Ｃ左右，有些需要低温处理。湿度：瓶内湿度100％，环境湿度要求70％－80％。气体；液体培养需要振荡增加空气，有的培养需要通气好，可用通气好封口膜。四、继代培养：芽的诱导及扩大繁殖（继代培养）易出现“驯化”现象，所以，要注意调整培养基激素浓度。　　　　五、移栽：试管苗驯化锻炼过程：1、移栽前一周将生根苗连瓶移到炼苗棚，2、移栽前2－3天打开瓶口炼苗3、然后移栽，高湿、弱光、温度适宜（20－250Ｃ）第四节植物快繁的商业化应用植物快繁的重要用途是商业化生产，但是，目前商业化生产的种类不多。原因168页，一、商业化生产规模及工艺流程（一）37\n试管苗生产规模的确定（快速繁殖工作的计划安排）1、商业化生产规模确定应以市场需求量为标准，要进行市场需求量预测。2、根据设备、人工、技术确定生产规模：（二）商业化实验室的设计：尽量布局合理、方便。（三）设施配套（四）工艺流程二、商业化生产及效益分析（一）试管苗增殖率的估算（二）快速繁殖工作的计划制定和实施1、计划制定2、生产计划实施（三）监控（四）效益分析通过成本核算可以了解：生产过程各种消耗、管理工作好坏、各项技术措施的效果、产品成本等。三、降低成本的措施（一）提高劳动生产率（二）减少设备投资，延长使用寿命。（三）降低消耗（四）降低污染，提高繁殖率和移栽成活率（五）简化培养基四、注意的问题（一）污染：污染指：组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌导致培养失败现象。1、污染的原因2、污染的预防措施（二）遗传稳定性（三）继代培养时材料的玻璃化（四）初代培养外植体的褐变：外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。（五）黄化：试管苗失绿，叶片黄色斑驳现象。[自学指导与训练方案]复习思考题：1、试述植物组织培养过程。37\n2、什么叫污染，污染的原因及预防措施有哪些？3、什么叫褐变、玻璃化各如何控制？4、简述植物组织培养过程降低成本的措施讨论：植物组织培养商业性生产的基本要求（设施、工艺、苗木）训练：植物组织培养商业性生产的成本与效益分析参考书：1、梅家训、丁习武主编组培快繁技术及其应用2003.4中国农业出版社2、高新一、王玉英编著植物无性繁殖实用技术2003.12金盾出版社3、熊丽等主编观赏花卉的组培培养与大规模生产2002.12化工出版社4、崔德才徐培文植物组织培养与工厂化育苗2003化学工业出版社[单元章节]第十一章　植物无病毒苗的培育　[教学目的]初步掌握无毒苗培养的意义，掌握热处理和微茎尖脱毒的原理及方法，基本掌握无病毒植物的鉴定和利用，掌握脱毒苗木的保存和利用方法。[重点难点]无病毒苗培育的意义热处理脱毒微茎尖培养脱毒病毒苗的鉴定无病繁殖与保存无毒苗的利用[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件[教学时数]2课时。[教学内容]第一节　无病毒苗培育一、病毒在植物上的危害病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%。二、无病毒苗培育的意义37\n用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。三、植物病毒传播方式植物病毒从一植株转移或扩散到其它植物的过程称为传播。传播是病毒在植物群体中的转移．可以分为介体传播和非介体传播两类．四、病症类型花卉病毒病的症状表现1.变色2.褪绿、黄化3.斑点、条纹4.环斑5.明脉、黄脉、脉带6.皱叶、卷叶7.丛生、矮化8.畸形　9.坏死五、茎尖培养脱毒1．茎尖培养脱毒原理感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少、这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在旺盛分裂的细胞中,代谢活性很高,使病毒无法复制。在茎尖中存在高水平内源生长素，抑制病毒增殖。第二节植物脱毒方法一、生物学方法（一）茎尖培养方法在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜(8—40倍)。除了在进行植物组织无菌培养一般工具外，还需要一套解剖刀。剥离茎尖（0.2-0.5mm，带1－2个叶原基)时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。（二）愈伤组织培养脱毒（三）茎尖微体嫁接（四）珠心组织培养脱毒二、物理脱毒的方法热处理又称温治疗法(theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。37\n三、化学脱毒的方法许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。四、综合脱毒的方法茎尖脱毒与热处理结合效果显著。如：用33－370Ｃ热处理大蒜鳞茎4周，取带2－3个叶原基的茎尖，脱毒效果比未热处理脱毒率提高22－25％。第三节　脱病毒植物的检测和保存一、脱病毒植物的检测（一）直接测定法：（二）指示植物(indmatingplant)法：(三）抗血清(antisemm)鉴定法：（四）电子显微镜(elecmcmicroscope)检查法：(五）酶联免疫鉴定法(EnzymelinkedimmunityabsorptionassayELISA)一、无病毒植物的利用和保存（一）无病毒苗的保存繁殖应很好地隔离与保存。一般温室或网室的灭过菌土壤中种植，原原种和原种在网室种，防蚜虫侵入。（二）无病毒苗的利用[自学指导与训练方案]复习思考题：1、无毒苗培育有何意义？　2、脱毒方法有哪几种？其原理是什么？3、微茎尖培养脱毒如何操作？　　4、脱毒苗如何鉴定？　自学指导：病毒植物的鉴定参考书：1、谭文登戴策刚观赏植物组织培养技术2001中国林业出版社[单元章节]第十二章草本花卉、水果、作物的组织培养[教学目的]掌握几种花卉、水果、作物的组织培养整套技术，并能独立开展组织培养工作。[重点难点]37\n外植体选择、处理、培养基配方、消毒接种、生根培养、移栽驯化、肥水管理。[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件[教学时数]4课时。[教学内容]第一节草莓一、草莓病毒病及其为害二、草莓脱病毒方法：1、茎尖组织培养脱毒法。2、热处理法和茎尖结合3、花药培养法。三、草莓无病毒苗的鉴定四、草莓病毒苗的繁殖与利用五、 无性系变异第二节大蒜一、症状特点：（一）常见的症状：（二）病原及发病特点二、大蒜脱毒关键技术　（一）培养基：从多组配方筛选出大蒜茎尖形成多芽最佳培养基：B5+3mg／L6BA+0.1mg／LNAA+30mg／LAD（腺嘌呤）；分离多芽培养成苗培养基：B5+0.1mg／LNAA+0.1mg／LBA；组培芽生根培养基：1/2B5+0.05mg／LNAA+0.01mg／LBA+0.2%AC促进组培苗形成鳞茎培养基：B5+0.1mg／LNAA+0.01mg／LBA+0.2%AC。剥离2～3个叶原基的茎尖，结合37℃处理鳞茎1个月，茎尖成苗率达96%，脱毒率达88%。（二）大蒜茎尖苗病毒检测技术　用指示植物法，SandwitchELISA和IEM技术检测大蒜茎尖苗，汰除叶面有黄条斑的病株和检测表现阳性结果的植株。对各级脱毒蒜种进行检测，提出核心原种、原原种、原种和合格良种的病株率不超过0.2%、0.5%、1.0%和10%的检验标准。三、脱毒蒜的增产效果　37\n四、脱毒蒜速繁技术1、茎尖脱毒2、花序轴分生组织培养微型鳞茎：3、利用气生鳞茎速繁：4、蒜盘培养脱毒：5、蒜盘圆顶培养脱毒：6、体细胞胚胎发生脱毒　五、病毒检测六、脱毒蒜良种繁育体系和应用规程　七、单倍体育种（一）大蒜抽苔时，取带有1－2cm花茎的花苞，用1％醋酸洋红染色，当花粉发育到单核期时采花苞，消毒处理后，剥离花苞，取出花药接到培（二）单倍体植株鉴定八、原生质体培养第三节葡萄的组织培养一.脱毒：（一）选材接种从田间生长旺盛的葡萄新梢（38℃，CO21200mg/L的人工气候箱处理30min或500Ｃ温水处理10-20min)顶端取1-2㎝的茎尖。除去幼叶后在75%酒精溶液中浸泡2-3s，消毒灭菌，以后用无菌水冲洗3次，再在0.1%升汞溶液中浸泡约5-6min，以后用无菌水冲洗4次。在无菌条件下分离出约0.2-0.3㎜长的茎尖，接种到培养基上。（二）植株再生（三）根诱导：（四）驯化与移栽：进行生根培养，1-2周后幼苗开始生根，1个月形成完整的根系，同时具备5-6片新叶。移栽时洗去根上的培养基，栽到蛭石基质内，使根系具有良好的通气条件，盖上塑料薄膜，经7-10d锻炼适应后可去掉，移栽成活率在90%左右。二、茎段培养：选材接种从田间生长旺盛的葡萄新梢顶端。消毒灭菌，在无菌条件下分离出约1-2cm长的带芽茎段，接种到培养基上。三、胚胎培养、花药培养、原生质体培养。[自学指导与训练方案]复习思考题1、草莓微茎尖脱毒的方法步骤？参考书：1、李云主编林花果菜组织培养快速育苗技术2001.6中国林业出版社2、熊丽等主编观赏花卉的组培培养与大规模生产2002.12化工出版社3、许继宏等主编药用植物组培培养技术2003.5中国农业出版社37\n4、谭文登戴策刚观赏植物组织培养技术2001中国林业出版社37