[农学]粮油检验-维生素

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第七节食品中维生素的测定一、概述生物体的生理生化反应都是在酶系统的催化作用下进行的，一些酶的催化体系包括小分子辅酶或辅基，而一些维生素就是辅酶或辅基的组成部分，如是羧化酶辅酶，是黄素蛋白的辅基。粮食、食品和饲料中的维生素含量极少，但对动物来说是非常重要的。因为，动物体内不能合成维生素，必须从食品或饲料中摄取，当摄入量不足时会出现维生素缺乏症，而过量摄入维生素，会产生中毒。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心1\n第七节食品中维生素的测定1.维生素分类维生素按溶解特性划分，可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。水溶性维生素有：硫胺素、核黄素、泛酸、维生素B6、叶酸、生物素、抗坏血酸、烟酸。脂溶性维生素有：视黄醇、钙化醇、生育酚、抗出血维生素。除维生素外，还有一些维生素的前体物，如胡萝卜素，即为维A原，在生物体内可以转变成维生素。现在工业化生产中，还有作为添加剂使用的维生素衍生物。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心2\n第七节食品中维生素的测定2.维生素类添加剂在食品和饲料中，除天然维生素以外，为了强化营养、增加抗氧化能力，常常还要添加一些维生素的衍生物。①维生素A醋酸酯、维生素A琥珀酸酯②硫胺素十六烷基硫酸盐、硫胺素-1，5-二磺酸盐、月桂基硫酸盐二苯硫胺素③核黄素磷酸酯钠、核黄素酪酸酯④抗坏血酸硬脂酸钠2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心3\n第七节食品中维生素的测定3.维生素的特性一般来讲，维生素对外界因素的影响非常敏感，在提取、测定及样品保存过程中要特别注意。酸碱氧光热维生素A※※维生素D※※※维生素E※※维生素K※※维生素B1※※※维生素B2※※※维生素B6※※泛酸※※※叶酸※※维生素B12※※维生素C※※※※维生素PP生物素2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心4\n第七节食品中维生素的测定4.维生素的测定方法粮食、食品和饲料中的维生素的主要有：高压液相色谱法、荧光分光光度法和比色法，微生物法已逐步被淘汰。其中，高压液相色谱法以其高分离能力、高灵敏度的检测，被广泛地应用。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心5\n第七节食品中维生素的测定二、维生素A和维生素E的测定维生素A、维生素E都是脂溶性维生素，它们对光、氧很敏感，在提取和测定过程中，要避光、隔氧进行，否则，它们迅速被氧化分解，使测定结果偏低，甚至测不到。维生素A只有动物性食品中含有，维生素E在动物性、植物性食品中都含有。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心6\n二、维生素A和E的测定(一)高压液相色谱法1.原理将样品中油脂皂化，用脂溶性溶剂提取维生素A和维生素E，采用高压液相色谱仪分离分析。色谱条件为C18柱，紫外检测器，反相色谱法进行分离，以苯并芘为内标物，内标法定量。高压液相色谱法分析维生素A时，采用正相色谱法和反相色谱法都可以进行。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心7\n二、维生素A和E的测定2.色谱分离系统选择如果采用正相色谱法，色谱柱主要是硅胶柱，而流动相是以正己烷为基本溶剂，加适量异丙醇、乙醚、正辛醇等试剂调节流动相极性。这样的色谱条件要求样品提取液应不含水和碱性成分。如果采用反相色谱法，色谱柱主要是C18柱，而流动相是以甲醇、乙腈为主要溶剂，水为极性调节剂的溶剂系统。样品提取液中的极性成分对反相色谱法的柱效影响不大，对于一些维生素含量高的样品，可以直接用油样或脂溶性溶剂的抽提物进行分析。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心8\n二、维生素A和E的测定3.分析维生素A或维生素E的色谱条件1）用于分析维生素A的HPLC系统2）用于分析维生素E的HPLC系统2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心9\n二、维生素A和E的测定4.分析步骤皂化→提取→洗涤→干燥→浓缩→定容→离心→色谱分析→结果计算2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心10\n二、维生素A和E的测定5.测定过程中的必须注意：①样品制备、前处理过程中要避光、加抗氧化剂VC操作，必要时用氮气隔离氧。②在进行色谱分析时，所用试剂纯度要分析纯以上，否则，可能带来新的干扰。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心11\n二、维生素A和E的测定③试剂、样品提取液必须用超滤膜进行过滤，将固体、流动相不溶性的胶体过滤掉。④对于分离不太好的结果，要正确选择色谱数据处理方法。⑤具有很强分离能力的色谱柱，可以将维生素A、维生素E的异构体分离，这时应对各异构体分别定量。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心12\n二、维生素A和E的测定（二）比色测定法维生素A1.原理维生素A在三氯甲烷溶液中，与三氯化锑作用生成蓝色物质，用分光光度计，于620nm波长处测定吸光度值。使用该方法测定维生素A时，维生素A的各种异构体、胡萝卜素及类胡萝卜素都可以与三氯化锑呈蓝色反应，这种蓝色物质在6秒钟内稳定。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心13\n二、维生素A和E的测定2.注意①由于显色后不能有较长的稳定时间，测定误差很大，必须由操作熟练的人员测定。②三氯化锑遇水产生白色沉淀，测定用样液必须彻底脱水。③这种方法所测的是维生素A及A原的总量。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心14\n第七节食品中维生素的测定三、胡萝卜素的测定胡萝卜素是维生素A原，胡萝卜素有多种异构体，其中，-胡萝卜素的生理效价最高，其次是-体和隐黄素。-胡萝卜素显深桔红色，它既可以作为营养强化剂，也可以作为食用色素。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心15\n三、胡萝卜素的测定1.原理食品中胡萝卜素以及其它色素用乙醚和丙酮提取，然后以石油醚为展开剂，进行纸层析分离。胡萝卜素分子极性最小，比移值最大，层析结束后，将胡萝卜素谱带剪下，用溶剂洗脱，再用分光光度计于450nm波长处测定吸光度值，标准曲线法定量。该方法的最小检出量为0.11g。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心16\n三、胡萝卜素的测定2.操作流程样品处理→提取→洗涤→浓缩→干燥→纸层析→洗脱→测定→结果计算2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心17\n三、胡萝卜素的测定3.测定方法1）样品前处理（1）样品需经低温干燥，以避免胡萝卜素被氧化。（2）对于低脂肪的果蔬类样品，可以直接丙酮-石油醚混合溶剂提取；植物油和高脂肪含量样品，必需经过皂化，去除脂类的干扰，然后用石油醚提取。（3）提取液还需要反复用硫酸钠水溶液洗涤，直至下层水溶液清亮为止，提取液还必须用水洗至中性，用无水硫酸钠干燥提取液（4）提取液减压浓缩干，然后重新定容，备用。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心18\n三、胡萝卜素的测定2）层析（1）吸取浓缩样液，点样。（2）以石油醚作为展开剂进行层析。（3）层析分离后，剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素色带，立即放入石油醚溶剂中洗脱。3）测定选择450nm的光为测定波长，以石油醚调节分光光度计的零点。测定标准系列，绘制标准曲线。测定样液的吸光度值，查标准曲线进行定量。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心19\n第七节食品中维生素的测定四、硫胺素的测定硫胺素属于水溶性的维生素，在碱性条件下不稳定。测定硫胺素时，可采用经重氮化反应后的比色法进行，也可以采用在碱性条件下，用铁氰化钾氧化为硫色素，进行荧光法或高压液相色谱法分析。还有采用紫外分光光度计直接测定硫胺素或焦磷酸硫胺素。国标GB/T14700--93规定了饲料原料、配合饲料、维生素预混料等样品中维生素的测定方法。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心20\n四、硫胺素的测定1.原理样品经酸水解、酶水解处理，用稀酸提取，提取液经人造浮石净化处理后，在碱性溶液中，高铁氰化钾将硫胺素氧化，生成一种具有蓝色荧光的硫色素。荧光法测定硫色素时，激发波长为365nm，发射波长为435nm。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心21\n四、硫胺素的测定2.人造浮石的活化取一定量的人造浮石，以10倍其容积的3%热乙酸洗涤两次，再用5倍其容积的25%热氯化钾洗涤，再用3%热乙酸洗涤，最后用蒸馏水洗至没有氯离子，干燥后密闭保存。活化好的浮石，必须做回收实验，回收率要在92%以上。如果活力不够，要重新活化或增加25%氯化钾溶液的处理次数。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心22\n四、硫胺素的测定3.操作流程水解、酶解样品→酸提取→净化→碱性氧化→荧光测定→结果计算1）提取硫胺素将样品粉碎加酸并打成匀浆，高压锅中高压酸解，冷却，加入糖化酶进行酶解。水解液过滤备用。样品进行酸解和酶解的目的，是将结合的、被淀粉及蛋白质吸附的硫胺素释放。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心23\n四、硫胺素的测定2）硫胺素提纯将滤液加到已装好浮石的柱子中，用热水淋洗两次，将提取液中的杂质洗脱。用一定量的热25%酸性氯化钾分次洗涤柱子，将被吸附的硫胺素洗脱，收集洗脱液，即为提纯的硫胺素。硫胺素标准溶液必须过浮石柱子，以消除浮石柱子回收率低带来的影响。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心24\n四、硫胺素的测定3）氧化硫胺素在样液管中，加15%氢氧化钠溶液，准确加一定量的正丁醇，加碱性铁氰化钾溶液，剧烈振摇，待分层后，取正丁醇溶液脱水。在硫色素的生成过程中，①样品中含有还原性杂质时，铁氰化钾溶液的用量要适量增加。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心25\n四、硫胺素的测定②硫胺素的氧化、萃取同步进行，硫胺素被氧化后，生成憎水性的硫色素而进入正丁醇中，同时避免了硫色素被铁氰化钾的氧化。③可以使用二氯化汞和溴化氰作为氧化剂，这两种氧化剂的的氧化专一性比铁氰化钾高，如对N-甲基烟酰胺的氧化。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心26\n四、硫胺素的测定4）测定用硫酸奎宁溶液校正荧光分光光度计。选择测定波长：激发波长365nm，发射波长435nm，分别测定空白试剂标准溶液、样品液的荧光强度值。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心27\n四、硫胺素的测定4.在使用荧光法测定中，影响测定结果的因素有：①仪器的不稳定，引起荧光读数的波动。②纯化硫色素时，浮石柱子的吸附活性不够高。③氧化硫胺素时，过量的碱性铁氰化钾氧化硫色素。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心28\n四、硫胺素的测定④在硫色素的正丁醇溶液中的荧光淬灭剂，引起的荧光淬灭。引起荧光淬灭的因素：a.碘离子、溴离子、氰酸根离子是典型的荧光淬灭剂b.荧光物质浓度太大时，溶液中溶质分子自撞。C.正丁醇溶液的pH引起的荧光淬灭。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心29\n第七节食品中维生素的测定五、荧光法测定核黄素核黄素微溶于水，水溶液中呈黄绿色荧光，不溶于有机溶剂，在强酸中稳定，碱性溶液中光照易分解。核黄素的测定方法主要有直接荧光法、光黄素荧光法和高压液相色谱法。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心30\n五、荧光法测定核黄素1.原理用酸水解样品，使VB2游离进入酸溶液中。经净化处理的提取液，用荧光分光光度计测定荧光强度。当用连二亚硫酸钠还原VB2为无荧光的物质后，测定样液中的荧光强度，还原前后荧光强度之差，即为样品中VB2的荧光强度，与标准比较定量。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心31\n五、荧光法测定核黄素2.操作流程酸水解样品→酸提取→氧化→柱层析净化→荧光测定→还原核黄素→荧光测定→结果计算2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心32\n五、荧光法测定核黄素2.操作步骤1）VB2提取样品用盐酸水解，水解液调节pH值，以沉淀蛋白质。对于含淀粉高的样品，加淀粉酶水解；含蛋白质高的样品，加木瓜蛋白酶水解。2）VB2提取液净化样品的酸提取液中色素等杂质经高锰酸钾氧化后，用双氧水去除多余的高锰酸钾，然后过硅镁吸附剂柱子，经丙酮、冰醋酸、水淋洗进一步净化提取液。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心33\n五、荧光法测定核黄素3）测定经净化处理的样品提取液，以440nm为激发波长，525nm为荧光波长，测定其荧光强度。加入连二亚硫酸钠，将VB2还原为无荧光物质，测定样液中杂质的荧光强度。二者之差即为样品中VB2的荧光强度。2021-8-26国家粮食储备局标准质量中心34