发育生物学实验讲义

发育生物学实验讲义

发育生物学实验讲义主编：余雪松贾伟章李浩明2007年7月（仅供内部使用，请勿外传）37\n前言发育生物学被公认为是当今生命科学的前沿分支学科，是研究生物体发育过程及其调控机制的一门学科。发育生物学不同于传统的胚胎学，它是生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等学科与胚胎学相互渗透的基础上发展形成的一门新兴的学科，是胚胎学的继承和发扬。发育生物学同时又是一门实验的科学，正是由于发育生物学实验技术的进步才推动了发育生物学的发展。关于发育生物学实验，国内目前尚无系统的实验教材。考虑到我院生物科学专业本科的课程设置特点以及我院的实验条件，在编写这本实验教材时设置了相关的实验，参考有关资料进行编写。考虑到学生用活胚胎作实验缺乏经验和实验内容尽可能多的涵盖重要的发育原理和研究方法，实验内容为生物发育模式的形态观察，以切片观察为主，同时以活的胚胎来观察发育过程并进行实验为补充。对于部分因课时和实验条件的限制可能暂时无法开展的实验，利用教学录像等多种手段让学生了解发育生物学实验技术的发展和应用。通过一些实验手段对生物的发育机制进行探讨。本课程通过对几种模式动物（海胆、文昌鱼、斑马鱼、鲫鱼、蛙、鸡等）生殖和发育过程的实验观察，促进学生对发育的时空连续性变化的理解和对生命系统的敏锐认识和重视；同时掌握发育生物学重要的原理和研究实验的基本技能。培养学生成为具有独立实验操作技能和一定分析解决问题能力的创新人才。由于时间仓促，水平有限，在内容和方法上可能还存在不少缺点错误，欢迎批判指正，以便在今后进行实验内容的调整和改进。余雪松贾伟章李浩明广东药学院生命科学与生物制药学院2007年7月37\n目录实验一海胆早期胚胎发育4实验二文昌鱼早期胚胎发育7实验三文昌鱼组织结构观察10实验四斑马鱼早期胚胎发育13实验五鲫鱼早期胚胎发育16实验六鲫鱼组织结构观察20实验七蛙早期胚胎发育24实验八蛙的人工催产及体外跌卵实验29实验九鸡卵的人工孵育和胚胎发育观察3237\n实验一：海胆早期胚胎发育一、实验生物海胆，别名刺锅子、海刺猬，体形呈圆球状，就像一个个带刺的紫色仙人球，因而得了个雅号—“海中刺客”。渔民常把它称为“海底树球”、“龙宫刺猬”。世界上现存的海胆约有850多种，我国沿海约有150多种。常见的如马粪海胆、大连紫海胆、心形海胆、刻肋海胆等。海胆是海洋里一种古老的生物，与海星、海参是近亲。据科学考证，它在地球上已有上亿年的生存史，它们在世界各大海洋中都生活过，以印度洋和太平洋的活动最为频繁。海胆（seaurchin）是生物科学史上最早被使用的模式生物，它的胚胎对早期发育生物学的发展有举足轻重的作用。早在1875年，奥斯卡·赫特维格（OscerHertiwig,1849-1922）就开始以海胆为材料研究受精过程中细胞核的作用。1890年后，海胆更在受精和早期胚胎发育的研究中起了重要作用。1891年，汉斯·德瑞熙（HansDriesh，1876－1941）在海胆中完成了海胆胚胎分裂实验，为现代发育生物学奠定了第一块观念里程碑。他在显微镜下把刚刚完成第一次分裂的海胆一分为二，结果发现，分开后的两个细胞各自形成了一个完整幼虫。这一实验的意义在于证明胚胎具有调整发育的能力，并使盛行一时的机械论发育思想完全破产，为现代发育生物学奠定了第一块观念里程碑。二、实验材料与实验仪器37\n实验材料：海胆早期胚胎发育切片，共六片：海胆受精卵装片，海胆卵2细胞装片，海胆卵4细胞装片，海胆卵8细胞装片，海胆卵16细胞装片，海胆卵囊胚期装片。实验仪器：光学显微镜三、实验内容主要利用切片观察海胆的早期胚胎发育过程，理解海胆这一特殊的模式生物的受精及其细胞分裂的过程和特点，并结合观察结果绘图。海胆：胚胎发育的早期事件37\n海胆是雌雄异体，雌体可终年怀卵，一年排卵数次。生长3年的海胆达到了它的成熟阶段，开始履行繁殖后代的重任。它们是群居性动物，在繁殖上，它有一种奇特的现象，就是在一个局部海区内，一旦有一只海胆把生殖细胞，无论精子或卵子排到水里，就会像广播一样把信息传给附近的每一个海胆，刺激这一区域所有性成熟的海胆都排精或排卵。这种怪现象被形容为“生殖传染病”。在自然条件下，海胆的胚胎发育过程为：在水温21-24℃的条件下，受精卵经约0.5小时进行第一次卵裂；12小时发育至囊胚期，且上浮水面；20小时囊胚破膜而出；24小时到原肠胚；第二天后到四腕幼体期，消化系统完善，并开始摄食，到10天发育到八腕期；第13天可见海胆原基出现；第20天时，已有3个叉棘出现，第一批5只管足伸出这就意味着海胆的胚胎期结束，进入了幼体期。在海胆原基内，除了内部的生长分化外，外表最易观察到的是第一批5只管足长成，并突破体表伸出体外，幼体借管足末端的吸盘吸附于底质上，成为新的运动器官，这时海胆开始营匍匐生活，幼体体表的腕等结构，随着变态的进展则逐渐萎缩，最终形成五辐射的幼海胆，从受精卵发育到完成变态，形成稚海胆的时间约20天。  37\n实验二：文昌鱼早期胚胎发育一、实验生物文昌鱼出现于距今五亿多年前，至今仍保持古代的特征及原始性状，被认为是与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，也可以说是脊椎动物始祖的现存代表。文昌鱼独特的进化地位，吸引了众多生物学家的目光，被认为是研究动物进化和动物胚胎发育的典型材料。文昌鱼从发现到现在仅仅只有200多年的历史，文昌鱼属于脊索动物门头索动物亚门。脊索动物门是动物界最高等的一个门，其形态结构复杂，生活方式多样，共同特征是具有脊索、背神经管、和咽鳃裂。脊索动物分属三个亚门，即尾索动物亚门（主要代表为海鞘）、头索动物亚门（主要代表为文昌鱼）和脊椎动物亚门。前两个亚门属于低等脊索动物，统称为原索动物。原索动物是介于脊椎动物和无脊椎动物之间的过渡类型，它既保留了无脊椎动物的一些特性，又具有脊椎动物的某些特点。文昌鱼是脊索动物门头索动物亚门的重要代表，具备脊椎动物的三大特征：脊索、背神经管和咽鳃裂。达尔文曾指出，文昌鱼的发现是一个伟大的发现，它使人们看到了5亿年前脊椎动物始祖的模样，提供了指示脊椎动物起源的钥匙。黑格尔把文昌鱼称作“最后的马希坎人”（Mohicans），在其1874年出版的《人类进化》中描述为“在所有已灭绝动物中唯有文昌鱼能使我们勾画出志留纪最早的脊椎动物祖先”。因此，文昌鱼的研究具有极大的学术价值，对探讨脊椎动物的起源和进化具有重要意义。二、实验材料与实验仪器实验材料：文昌鱼早期胚胎发育切片，共六片：文昌鱼受精卵装片，文昌鱼2细胞装片，文昌鱼4细胞装片，文昌鱼8细胞装片，文昌鱼16细胞装片，文昌鱼囊胚期装片。实验仪器：光学显微镜37\n三、实验内容观察文昌鱼的早期胚胎发育过程，理解文昌鱼在发育生物学中所处的特殊的进化地位。文昌鱼一年产卵3～4次，产卵时间在4～7月，雌雄异体。不同海域气候不同产卵时间也有所差别，如我国广东和福建海域由于气温较高，一般在每年的4月份即开始产卵，而青岛文昌鱼的产卵高峰期一般在7月初。文昌鱼的生殖细胞成熟后，从围鳃腔中排到体外，在海水中自然受精发育，受精卵迅速进行卵裂，很快发育成为被有纤毛的幼体，沉人海底，发生变态，3个月以后发育为成体。文昌鱼发育到11个月左右即开始性成熟，但在外形上雌、雄性并无明显区别，只是在生殖腺的颜色上略可分辨；精巢呈乳白色，卵巢呈淡黄色。文昌鱼的早期胚胎发育关于文昌鱼胚胎发育，经过著名美国胚胎学家康克林数十年的研究，有了比较系统的认识。我国著名的生物学家童第周先生等在20世纪50～6037\n年代进行的一系列研究工作，对文昌鱼卵的发育能力提出了重要的修正意见，使我们对文昌鱼胚胎发育的规律有了进一步的认识。尽管如此，文昌鱼的胚胎发育并没有引起发育学家的足够重视。直到近年来分子生物学的发展，揭示了文昌鱼的胚胎发育是脊椎动物胚胎发育的原型，才引起了人们的兴趣，受到广泛的关注。文昌鱼的胚胎发育分为受精卵、桑椹胚、囊胚、原肠胚、神经胚、幼体等阶段。文昌鱼早期胚胎发育与棘皮动物相似，伴随着精子的进入和细胞质的重排，卵母细胞形成了动植物极的极性。受精卵不久即开始分裂，由于卵黄少，为均卵黄，因此卵的分裂为全裂，且为均等分裂。第一次和第二次分裂皆为经裂，分成四个细胞，第三次分裂为纬裂，分成上下八个细胞，如此继续分裂下去，许多细胞结成一个实心的圆球，称桑椹胚。桑椹胚一方面继续地分裂，中心的细胞渐向表面迁移，因而变成一个空心的圆球，此时期的胚胎称囊胚，中间的空腔内充满胶状液体，称囊胚腔。囊胚上端的细胞稍小，称动物极，下端的细胞稍大，称植物极。此后的胚胎发育则显示出与脊椎动物相似，囊胚植物极的大细胞以内陷的方式向囊胚腔陷入，囊胚腔被挤掉，而另形成一个新的腔，称为原肠腔，此阶段称原肠胚。文昌鱼的原肠作用很简单，是典型的内陷，可能代表了后口动物原肠作用的原型。囊胚的植物极向囊胚腔内陷，形成了一个开口很大的胚孔，胚孔在后来闭合。此时胚胎具备内外两层细胞，贴着原肠腔的一层细胞，称为中胚层和内胚层（或称为中内胚层），以后分化成脊索、肌节和消化管等；与外界相接触的一层细胞，称为外胚层，以后分化成表皮和神经系统。以后胚胎逐渐延长，原口逐渐缩小，此时胚胎的前、后、背、腹已能区别。有原口的一端相当于胚体的后端，相对的另一端为胚体的前端，平坦的一面相当于背面，其对面稍凸出的一侧即为腹面。此时，胚胎表面已具纤毛，胚胎能在卵黄膜内回旋运动，此阶段为神经胚。大约经过24小时胚胎即具有与成体胚相似的形态，发育成为幼体，整个幼体阶段约持续3个月，然后发育为成体。实验三：文昌鱼组织结构观察37\n一、实验生物文昌鱼似鱼非鱼,它个体很小,构造简单而且原始。文昌鱼的成体结构和胚胎发生过程与无脊椎动物有相似之处，如表皮为单层上皮，结缔组织不发达，胚胎具纤毛能在海水中游动等。另一发面，脊索动物的三大特征它身上均以非常简单的形式终生保留，可以说它是一个典型的脊索动物的缩影。文昌鱼没有脊柱,只是有了脊柱的雏型脊索，由于脊索纵贯身体全长并直达身体最前端延伸到神经管的前面，故称头索动物。文昌鱼的中枢神经是一条长的管状物,位于脊索下面,还没有从躯干里分化出真正的头和脑，所以又叫无头类。背神经管的前端略微大些,可认为是脑,但很不明显。文昌鱼不具备脊椎动物特有的神经嵴细胞、神经基板、精密的形态上分节的脑、成对的感觉器官和内骨骼。然而,相对于无脊椎动物来说,这种既没有脊椎又没有大脑的头索动物,毕竟往前发展了一步。文昌鱼是脊索动物门头索动物亚门的重要代表，具备脊椎动物的三大特征：脊索、背神经管和咽鳃裂。脊索位于身体背部背部，消化道上方及神经管下方，是一条支持身体纵轴由柔软而有弹性的结缔组织组成的棒状结构，外被脊索鞘。脊索在脊索动物门的低等种类中终身存在，有的种类仅胚胎和幼体存在，高等脊索动物的脊索仅出现在胚胎期，成长时逐步被脊柱取代。背神经管则位于脊索的上方，是来源于外胚层的中枢神经系统，呈管状结构。在高等脊椎动物中，背神经管位前方分化为脑，后段成为脊髓。咽鳃裂内有咽鳃，是呼吸器官。低等种类咽鳃裂终生存在，高等种类只见于胚胎或幼体阶段，随后完全消失，成体以肺呼吸。另外，脊索动物还具有其它特征，比如心脏存在的种类，其位置总是在消化道的腹面；尾部存在的种类，其位置总是在肛门的后方(肛后尾)；骨骼系统是内骨骼，起源于中胚层，能随机体的生长而增长。文昌鱼对自然生态环境的要求十分严格和苛刻,在世界分布范围也十分有限。文昌鱼栖息于浅海疏松的沙滩里,文昌鱼不善游泳,几乎没有自卫能力，却有惊人的钻沙本领，一般可生活三四年。文昌鱼对沙质中也有严格的选择，粗沙和细沙搭配均匀有利于文昌鱼的自由活动，而是泥质地(细沙中带有淤泥)37\n比较硬，文昌鱼钻不进去，另外细沙还会阻碍它的呼吸。它经常把身体的大部分埋在沙里，仅有前半截身体露在沙外，白天半截身体躲在沙砾之中，依赖水流带来浮游生物及硅、藻植物供它吃食；到了晚间才是它活跃的时刻，它离开沙窝,弹射到水面活动，一旦遇到惊扰，又游回沙滩窝内。文昌鱼游动时以螺旋形方式前进。二、实验材料与实验仪器实验材料：文昌鱼组织结构切片，共九片：文昌鱼整体装片，文昌鱼过口签横切，文昌鱼过咽横切，文昌鱼过肠横切，文昌鱼过性腺横切，文昌鱼尾部横切，文昌鱼头部连续纵切，文昌鱼中部连续纵切，文昌鱼尾部连续纵切。实验仪器：光学显微镜三、实验内容观察文昌鱼的成体结构，以及组织结构特点，结合文昌鱼所处的进化地位理解生物在进化过程中组织和器官的进化。文昌鱼的形态结构十分简单，身体细长而侧扁，长梭状，形似小鱼，但无头与躯干之分，西欧人称它为尖鱼，或称之为“海矛”。文昌鱼身长3～7厘米，不同产地的文昌鱼个体大小也有一定的差别，就我国而言以青岛文昌鱼个体最小，厦门文昌鱼个体稍大，而以广东湛江和茂名发现的文昌鱼的个体最大。文昌鱼的解剖图nervecord,神经索；notochord,脊索；body-wallmusclesk,体壁肌肉；intestine,肠；oralcirri,口须；pharyngealgillslits,咽鳃裂；gonad,生殖腺；atrialcavity,围鳃腔；atriopore,围鳃腔孔；anus,肛门。文昌鱼全身呈粉红色、半透明状，透过皮肤可见的肌肉，其身体两侧肌节呈“<”形交替排列。咽是脊索腹方呈长椭圆形的一个大腔，37\n腮裂不直接通向体表开孔，而是被皮肤和肌肉包裹，形成一对围绕咽部的“围腮腔”。文昌没有专门的呼吸器官，海水流经鳃裂时气体进行交换，氧气吸入。文昌鱼的肠为咽后的一条直管，前端较粗大，后部渐细，末端以肛门开口于身体左侧。在肠管前部腹面向前右方伸出一盲囊，称肝盲囊。文昌鱼的“心脏”只是一根能跳动的腹心管，没有眼晴、耳朵、鼻子等感觉器官的分化，消化器官也没有分化，除了口和咽喉区分外，仅有一根直肠通至肛门。实验四：斑马鱼早期胚胎发育37\n一、实验生物斑马鱼，因身上类似斑马条纹的斑带而得名。斑马鱼又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼，鲤科属，原产南亚印度，分布于缅甸、孟加拉、新加坡。斑马鱼长4-6厘米，体呈纺锤形，稍侧扁。斑马鱼头稍尖身上有斑马样的条纹，故得名斑马鱼。其背部为橄榄色，体侧从头至尾布满多条蓝色条纹，雄鱼为深蓝间柠檬色条纹，雌鱼为蓝色间银灰色条纹。斑马鱼眼眶虹膜黄色，泛红光。斑马鱼的臀鳍宽大。与背鳍相对应，胸鳍较小。斑马鱼的品种约有10多种，主要区别在条纹和色彩上，也有鳍行上的变化。如有长鳍斑马鱼、金丝斑马鱼、闪电斑马鱼、大斑马鱼等。斑马鱼的饲养要求：斑马鱼性情温和，活泼好动，几乎一刻不停的游动。其对饲水水质要求不苛刻，喜在酸碱度中性的水中生活，喜新水，适宜水温21-26摄氏度。但斑马鱼既耐寒又耐热，水温在15-40摄氏度之间仍可生活。斑马鱼喜在上层水域活动觅食，对饵料不挑剔，各种鱼虫及人工饲料均可投喂。饲养斑马鱼最好在缸底铺些较大的卵石，便于沉淀物聚集，不使水浑浊。它不进攻杀害其它鱼，适宜混养。斑马鱼色彩美丽，饲养条件粗放，因而是人们最喜欢养的热带鱼之一。二、实验材料与实验仪器实验材料：实验室饲养的性成熟的斑马鱼实验仪器：鱼缸，吸管，培养皿，温度计，光学显微镜等。37\n三、实验内容观察活体斑马鱼的成体结构，以及组织结构特点，掌握斑马鱼的实验室饲养方法、受精和胚胎发育的过程，以及胚胎的收集和处理。理解其在人类疾病研究中所处的特殊的地位。斑马鱼容易饲养，3个月就达到其生殖成熟期。同时斑马鱼的胚胎发育是在体外完成的，透明可见，这不仅使科学家很容易得到胚胎，而且还能在显微镜下直接观察到斑马鱼胚胎发育的过程。斑马鱼是人类疾病研究的重要生物。斑马鱼对于癌症研究来说是一个非常有价值的模型，它们能象人类一样患癌症，而且遗传背景相对简单。研究人员为什么单独选中了斑马鱼呢？这是因为这种鱼具有哺乳动物的大多数生化和生理机能，它比实验鼠繁育后代和生长的速度要快，喂养的费用也小。另外，这种鱼的胚胎是透明的，便于研究人员在鱼的发育过程中用冷光或荧光来观察基因的变化。斑马鱼的雌雄鉴别与繁殖：斑马鱼的雌雄不难区分，雄斑马鱼鱼体修长，鳍大，体色偏黄，臀鳍呈棕黄色，条纹显著；雌鱼鱼体较肥大，体色较淡，偏蓝，臀鳍呈淡黄色，怀卵期鱼腹膨大明显。斑马鱼属卵生鱼类，4月龄进入性成熟期，一般用5月龄鱼繁殖较好。斑马鱼的繁殖比较容易，37\n用水要求pH6.5-7.5,硬度6-8，水温25-26摄氏度。斑马鱼最喜欢自食其卵，因此繁殖缸内铺小石头及水草，便于落卵附着。繁殖时可按雌雄鱼1：2的比例防入繁殖缸内，一般头天晚上防入，第二天上午或中午就可以产卵受精。排完卵要将种鱼捞出另养。一条雌鱼每次可排卵300-1000粒不等。受精卵经2-3天可孵出仔鱼，再经2天仔鱼开始游动觅食，开始先以“洄水”喂之，10天后可改喂其他小型鱼虫。斑马鱼的繁殖周期约7天左右，一年可连续繁殖6-7次，而且产卵量高。实验五：鲫鱼早期胚胎发育37\n一、实验生物胚胎发育是基因差异表达、胚胎不同区域间相互作用，以及各种信号分子和信传导途径间复杂的相互作用的结果。胚胎发育的起点是受精卵的形成，而后经过卵裂、原肠形成、器官发生和成熟等阶段，最后形成具有生命活动能力的有机体。在脊椎动物胚胎的发育初期，原肠作用会发生广泛的细胞增殖、分化和与之相关的模式运动，产生三个有不同发育命运的胚层：内胚层、中胚层和外胚层，构成所有器官形成的细胞基础。在发育过程中，每一物种都有其特定的发育模式。发育是物种遗传信息按照特定的时间和空间表达的结果，是生物遗传信息与内外环境因子相互作用的结果。鲫鱼个体发育从卵细胞受精开始，卵子受精和激活之后发生卵裂。细胞的数目越来越多，而个头越来越小。发育的这一时期叫做卵裂。其表现是卵子表面出现沟。处于卵裂期的细胞叫做卵裂球。原肠胚期是胚胎发育过程中一个极为重要的时期，囊胚细胞通过运动而发生细胞重排，使胚体细胞重新定位，初步形成多胚层的胚体。通过原肠胚期的细胞运动，胚体形成了三个胚层――内胚层、中胚层和外胚层的分化，同时也开始了新形成胚层之间的相互作用，进而形成结构复杂的胚胎和有机体。二、实验材料与实验仪器实验材料：鲫鱼早期胚胎发育装片，共八片：鲫鱼受精卵装片，鲫鱼卵二细胞装片，鲫鱼卵四细胞装片，鲫鱼卵八细胞装片，鲫鱼十六细胞装片，鲫鱼卵囊胚期装片，鲫鱼卵囊胚期切片，鲫鱼卵原肠胚切片。实验仪器：光学显微镜等。三、实验内容观察活体鲫鱼的个体胚胎发育的过程鱼类的卵裂卵子受精和激活之后发生卵裂。精卵融合后，受精卵仍然是单个细胞，其任务是产生含有数以百万计细胞的多细胞有机体，因此，细胞必须发生迅速分裂。37\n合子高速分裂，而不伴随体积和物质的增加，细胞的数目越来越多，而个头越来越小。发育的这一时期叫做卵裂。其表现是卵子表面出现沟。处于卵裂期的细胞叫做卵裂球。不同卵裂球之间已经开始产生差异，并最终发育成不同类型的细胞。在不同的物种中，卵裂的方式是不同的，它是一个受遗传控制的过程。一个物种的卵裂方式主要由两个因素决定，一是卵黄的含量及其在细胞质内的分布，二是卵子细胞质中影响纺锤体形成的时间和角度的因子。卵黄含量和分布决定卵裂发生的部位及卵裂球的相对大小。如果卵子的一极卵黄蛋白相对较少，则该极细胞分裂速率就相对较快。富含卵黄的一极叫植物极，而卵黄相对较少的一极叫动物极。合子的核一般靠近动物极。卵黄相对较少（少黄卵和中量黄卵）的合子的卵裂方式一般为完全卵裂，即是说卵裂后整个卵子被完全分割。多黄卵受精后形成的合子卵裂时仅有一部分细胞质被分割，而卵黄部分不分裂，因而称为部分卵裂。部分卵裂可以是盘状的，如鱼类、鸟类，也可以是表面的，如昆虫卵。鲫鱼卵裂在动物极的胚盘里进行。卵裂非常迅速，头12次卵裂是同步的，在卵子的动物极形成了一个细胞团。起初所有的细胞之间以及它们与卵黄细胞之间都有开放的连接，中等大小的分子（17kDa左右）都能自由地从一个卵裂球达到另一个卵裂球。胚胎从第10次卵裂开始进入中囊胚转换：合子的基因开始转录，细胞分裂减慢，细胞明显开始移动。此时细胞分化成两种，第一种是卵黄多核层。卵黄多核是由第9次或第10次卵裂时最靠近植物极的胚盘细胞与卵黄细胞融合生成的。在卵黄细胞中贴近胚盘的细胞质里有多个细胞核呈环状排列。当胚盘细胞向植物极扩展时，一些卵黄多核层的细胞核在胚盘下移动，形成内卵黄多核层；而另一些卵黄多核层细胞核将随着胚盘向植物极移动，并沿卵黄表面延伸至胚盘的边缘之外，形成外卵黄多核层。在中囊胚转换点分化出的第二种细胞群是包被层)细胞，它们是胚盘最外层的细胞，其厚度仅有一层细胞。包被层细胞最终发育成胎皮，是胚胎外面的一层保护膜，并在后期胚胎发育被脱掉。在包被层和卵黄多核层之间是深层细胞，它们将发育成胚体。荧光染料示踪研究表明，早期胚盘细胞的分化方向尚未被决定，而在原肠胚形成前，胚胎中的每个细胞的发育命运已被决定。37\n鱼类的原肠作用与三胚层的形成1．中囊胚转换原肠胚期是胚胎发育过程中一个极为重要的时期。在这一时期，囊胚细胞通过运动而发生细胞重排，使胚体细胞重新定位，初步形成多胚层的胚体。预定形成内胚层和中胚层的细胞迁移至胚体内部，而预定形成诸如皮肤以及神经组织的细胞仍分布在细胞表面。通过原肠胚期的细胞运动，胚体形成了三个胚层――内胚层、中胚层和外胚层的分化，同时也开始了新形成胚层之间的相互作用，进而形成结构复杂的胚胎和有机体。在原肠胚期，细胞核控制细胞分化的作用日益明显，胚胎细胞开始合成新的各种类型的RNA和专一性的蛋白质。受精卵卵裂进行到一定次数后，细胞分裂的同步性丧失，合子基因开始表达，细胞获得一定的运动能力。这一过程称为中囊胚转换中囊胚转换发生的时间可能由细胞的核质比例所调节的，单倍体鱼类较二倍体鱼类迟一个细胞周期进入中囊胚转换，而四倍体鱼类则提早一个周期进入中囊胚转换。一般认为，中囊胚转换是由染色质上的某些成份启动了细胞质中一些目前尚未知道的特殊因子而形成的。原肠形成过程中最早的细胞运动即是卵黄上部胚盘细胞的外包。起初，胚盘内层细胞向外运动插入外层表皮细胞中；接着,这些细胞继续在卵黄表面移动直至将其完全包裹。这些细胞运动的动力并非来自细胞自身，而是由位于卵黄顶部的卵黄合胞层的自动扩展所提供的。包被层与卵黄合胞层紧密结合并在其牵引下向下扩展，而胚盘深层细胞则逐渐填充由包被层和卵黄合胞层在外包过程中所形成的腔隙。在这一过程完成之后，胚盘细胞回折至卵黄顶部，卵黄合胞层则继续向下扩展，包裹所有卵黄细胞。在迁移过程中，胚盘一侧明显变厚，细胞活性染色标记实验证明胚盘较薄一侧为未来胚体的背侧。37\n2．胚盘的形成胚盘形成在胚盘细胞下包至卵黄的1/2处时，整个囊胚边缘部细胞移动缓慢，且受到图1-2斑马鱼原肠形成时的细胞运动。表胚层的牵制，因而在该处形成略厚的胚层部分称为胚环，其上层细胞称为上胚层，下层细胞称为下胚层。上胚层细胞可产生溶解酶，能溶解和液化卵黄所含的营养物质，通过胚盘下腔供给胚盘细胞，是供应胚胎发育所需营养物质的主要结构。下层细胞会聚并沿未来头-背-尾线的子午线聚集，这个聚集体称为胚盾或原条，此处将形成原始轴器官。随着外包的继续，胚层扩展到将整个卵黄团包起来时，原条增长并延伸至动-植物极。其发育潜能包括发育成神经外胚层（上胚层中）和中胚层（聚集的下层细胞），但不出现神经褶，而出现一个从上胚层上脱离的实心神经龙骨脊。在神经龙骨脊下，聚集的下层细胞自组形成脊索和体节。后来到达的下层细胞通过形成外侧板补充中胚层。中胚层的下方形成内胚层上皮层。有时候，分离的神经龙骨脊作为一个神经棒保存下来，后来，中心管把这个神经棒转变成神经管。管的前端变宽生成脑。鱼胚胎的透明性使可能观察到活鱼眼的发育以及由耳基板发育成内耳，甚至神经的生长，如脊神经的生长。3．三胚层与器官的形成随着原肠作用的完成，三胚层也随之建立。在随后的胚胎发育过程中，三胚层逐渐分化为动物的各种器官，从而行使相应的生理功能。37\n实验六：鲫鱼组织结构观察一实验生物鲫鱼又叫河鲫。体侧扁而高，腹部圆，头较小，吻钝，口端位呈弧型；眼较小，眼间宽而隆起。鳞大，侧线平直，侧线鳞27～35。背鳍基部较长，鳍条3，15～20，臀鳍条3，5～7，背、臀鳍末根不分枝，鳍条均为后缘具锯齿的硬刺。下咽齿1行，4～4，侧扁，呈铲形。鳃耙细长，呈披针形，排列紧密。腹膜黑色。体呈银灰色，背部较暗，鳍灰。因生存的环境不同，形体与颜色也有所差异。其肉质鲜美，营养丰富。个体较小，一般250克以上就算大鲫鱼了，超过1000克的数量不是很多。鲫鱼的家族成员广，有银灰鲫鱼、银鲫鱼、百鲫鱼、彩色鲫鱼、金鲫鱼、乌鲫鱼等多个品种。鲫鱼栖息于水的下层，鲫鱼是底栖性鱼类，经常栖息在杂草丛生的水域，游弋到有腐殖质的水底觅食。喜欢清洁水域和水草，清洁水域溶氧充足，且微生物等杂物少，水质无污染，在此水域游动觅食有舒适感，食欲旺。水草丛生处有饵鱼爱吃的食物，且隐蔽性强。同时水草还是鱼儿产卵繁殖的天然产床。鲫鱼性情温顺、文静，警觉性很高。食性杂，四季寻食，以荤为主，同时喜吃植物性饵料，也吃有机碎屑及底栖小动物。一年四季，只要水温适宜，随时都在觅食。喜温暖，惧酷热，怕强光，鲫鱼是广温性鱼类，适合鲤鱼生存的最佳温度是15℃～25℃，在这个温度范围内，鲫鱼的活动能力最强，食欲旺盛。喜活水，这是因为活水不仅带来了充足的氧气。鲫鱼生性喜欢群集。生长缓慢。繁殖能力强，鲫鱼的性腺较其他鱼成熟得早，隔年鱼便能产卵；而且产卵期长，从春季一直可持续到秋季，产卵数量多。鲫鱼繁殖能力强是它分布广、数量多的一个重要原因。37\n二实验目的和要求学习鲫鱼解剖的常规操作；了解成体鲫鱼的结构特征三实验仪器白色解剖盘、解剖剪、镊子、HB铅笔、2H或3H铅笔、绘图橡皮、直尺、光学显微镜等。四实验方法与步骤：一外形观察取活鲫鱼，置于解剖盘中观察。鲫鱼外形呈纺锤形，左右侧扁，全身可分为头、躯干和尾三部分。1、头部：口在端部，两侧无口须；有成对的鼻孔和眼；头两侧有鳃盖。2、躯干：鲫鱼全身被覆瓦状排列的圆鳞，两侧中间的一行鳞片均具有小孔，形成侧线，此行鳞片称为侧线鳞，主要起感知水流方向、速度、障碍物等作用。体具有成对的胸鳍和腹鳍；不成对的背鳍、臀鳍和尾鳍。肛门和泄殖孔分别开在腹部臀鳍之前。二内部解剖和观察取活鲫鱼放在40度温水中处死，5分钟后取出放在解剖盘里；使腹部向上，用解剖剪从肛门向前剪开，沿腹中线经鳍中间剪到下颌（第一剪）之后，再使鱼侧卧，左侧向上，自肛门前的开口向背方剪开，沿脊柱下方剪至鳃盖后缘（第二剪），再沿鳃盖后缘剪至胸鳍之前（第三剪），除去左侧体壁，即可观察。鲫鱼的内脏包括消化系统，呼吸系统，泄殖系统和循环系统的一部分。37\n1、消化系统：包括由口腔、咽、食道和肠组成的消化道以及由肝胰脏、胆囊组成的消化腺。（1）口腔：剪去鳃盖及一部分上颌，可见口腔由上下颌合成，颌无齿，口腔背壁由厚的肌肉组成，表面有粘膜，腔底后半部有一不能移动的三角形舌。（2）咽：口腔后，左右两侧是鳃裂，咽齿即位于此。（3）食道：咽的后方，很短，背面通有鳔管。（4）肠：接于咽后，曲折盘旋，为体长2～3倍，前粗后细。肠的前部三分之二为小肠，最后一部分叫直肠，直肠后接肛门。（5）肝胰脏：肝胰脏为暗红色，从胸腹腔横膈膜稍后起，复盖在各部之间。（6）胆囊：椭圆形，深绿色，大部分埋在肝胰脏内，由胆囊发出输胆管，开口于肠前部。2、呼吸系统：主要是鳃。鳃是鱼的呼吸器官，有丰富的毛细血管，与外界（水）气体交换就是在水滤过鳃丝的时候完成的。（1）鳃盖膜：鳃盖后缘的薄膜。（2）鳃弓：位于咽的两侧，共4对。（3）鳃片：由鳃丝组成的片状物，每一鳃丝两侧又有许多突起的鳃小片。（4）鳃耙：鳃弓的内凹面有两行三角形的突起，左右互生。（5）鳔：位于胸腹腔的背侧，分前后两室，为银白色胶质囊。前室紧接在第4脊椎骨的悬器上，后室发出鳔管，通到肠的背面。主要作用不是呼吸，而是承担调节比重的工作，使鱼能够在水中自由地沉浮。3、泄殖系统：包括由肾脏、输尿管、膀胱组成的泌尿器官和由精巢、输精管或卵巢、输卵管组成的生殖器官。（1）肾脏：位于脊柱下方，紧贴在腹腔的背面，呈深红色。（2）输尿管：从每个肾脏通出一条细管，沿腹腔背壁向后走，在接近末端处汇合，进入膀胱。（3）膀胱：输尿管后方的一个似盾形的囊。（4）精巢：性成熟的精巢纯白色，呈扁的长囊状，左右各一，未成熟的往往呈淡红色，常左右不均称且有分裂缺陷处。（5）输精管：在精巢后端，很短，左右两管向后汇合而成，通入泄殖窦。37\n（6）卵巢：一对，性未成熟的卵巢淡橙黄色，呈长带状，性成熟的呈微黄红色，长囊形，几乎充满整个体腔，内有许多小形的卵。（7）输卵管：位于卵巢的后端，很短，左右两管向后汇合，开口于泄殖窦。4、循环系统：小心的剪开围心腔，可见心脏，是由静脉窦、心房、心室组成；再观察鳃部动脉，可见动脉球，腹大动脉，入鳃动脉和鳃动脉。（1）静脉窦：心房和心室后侧的暗红色长囊，背侧为古维尔氏管，前壁与心耳相通。（2）心房：位于静脉窦的前方：呈暗红色，囊状。（3）心室：在心房的前方，淡红色，倒圆锥形，壁很厚，收缩能力强。（4）动脉球：紧接在心室的前面，为腹大动脉基部的膨大部分，呈圆锥形，壁厚，白色。（5）腹大动脉：自动脉球向前发出的一条相当粗大的血管，位于左右鳃的腹面中央。（6）入鳃动脉：由腹大动脉两侧分出的成对分支，共4对，分别进入鳃弓。（7）出鳃动脉：与入鳃动脉相对应，在副蝶骨，前耳骨及外枕骨的底叶可。5、循环系统：（1）脾脏：位于小肠前部背面，体积较大，细长，深红色。（2）肾脏，其中头肾位于肾脏的最前端，在免疫系统的个体发育过程中占有重要地位。（3）胸腺，一般位于鳃盖基部靠近脊柱的乳白色结构，为鱼类免疫的发生中心，随着个体的发育，胸腺逐渐退回。37\n实验七：蛙早期胚胎发育一、实验生物蛙类是指青蛙(黑斑蛙)、蟾蜍(俗称癞蛤蟆)等没有尾巴的两栖动物，它们在分类上是属于脊索动物门、脊椎动物亚门、两栖纲。由于皮肤裸露，不能有效地防止体内水分的蒸发，因此它们一生离不开水或潮湿的环境，怕干旱和寒冷。所以大部分生活在热带和温带多雨地区，分布在寒带的种类极少。我国的蛙类有130种左右，它们几乎都是消灭森林和农田害虫的能手。在农田里常见的蛙类有黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、花背蟾蜍等等。从古巴引入的牛蛙可算是蛙中的“巨人”，体长可达20厘米。它那哞哞的鸣声很像牛叫，所以叫牛蛙。蛙类的生殖特点是雌雄异体、水中受精，属于卵生。繁殖的时间大约在每年四月中下旬。在生殖过程中，蛙类有一个非常特殊的现象─抱对。需要说明的是，蛙类的抱对并不是在进行交配，只是生殖过程中的一个环节，研究表明，如果人为地把雌雄青蛙分开(即没有抱对的过程)，那么即使是在青蛙的繁殖期里，雌蛙也不能排出卵细胞。可见抱对的生物学意义，主要是通过抱对，可以促使雌蛙排卵。一般蛙类都在水中产卵、受精，卵孵化后变成蝌蚪，在水中生活，然后变成幼蛙登陆活动。不过树蛙的产卵方法与众不同，斑腿树蛙产出的卵好像一团白色的肥皂沫，又像一团奶油，粘附在水草上。最有趣的是峨眉树蛙，它把卵块产在水边的树叶上，卵就在卵块中发育，然后落到湖里，继续发育。又如鸣声悦耳的弹琴蛙，在产卵前还会先筑一个泥窝，然后把卵产在里面。有些属于树蛙的蛙类并不上树，而是生活在水里。有些树蛙如红蹼树蛙和黑蹼树蛙，指、趾间有宽大的蹼，能由高处的树枝向低处展蹼滑翔，所以又叫飞蛙。有吸盘的蛙类除了树蛙外，还有雨蛙和湍蛙。其中以湍蛙比较特别，它们喜欢生活在湍急的水域中，能敏捷地穿过急流，爬登岩石。湍蛙的蝌蚪也很奇特，它的腹部有一个吸盘，能吸附在岩石上，以免被急流冲去。有“胡子”的蟾蜍是我国特有的珍奇蛙类，最早发现在峨嵋山，后来在南方几省相继发现。这种蛙吻部宽圆、扁平，雄性上颌缘有椎形角质黑刺12—16根，所以叫胡子蟾。这些“胡子”的功能目前还在人们的研究之中。37\n二、实验材料与实验仪器实验材料：蛙早期胚胎发育装片，共九片：蛙卵单细胞切片，蛙卵2细胞切片，蛙卵分裂早期切片，蛙卵分裂晚期切片，蛙卵囊胚早期，蛙卵囊胚晚期切片，蛙原肠胚早期切片，蛙原肠胚晚期切片，蛙神经板期切片，蛙神经沟期切片，蛙神经管期切片。实验仪器：光学显微镜等。三、实验内容本实验以蛙的胚胎发育为例，观察器官发生的过程。一、蛙的神经胚形成：在原肠晚期，胚孔逐渐缩小。当卵黄栓渐渐缩入胚体内方时，胚体背侧中央的神经外胚层出现一盾形区，颜色较淡，即为神经板（neuralplate），其后端位于胚孔上，形状稍狭窄，愈往前则愈宽。数小时后，神经板的边缘增厚，形成一对平行的纵褶，称为神经褶（neuralfold）。两褶间的凹沟为神经沟（neural37\ngroove）。两褶渐渐向中央靠拢，最后互相合并形成一神经管（neuraltube），但尚有部分神经褶的细胞留在神经管外，位于神经管背部外侧，左右各一纵条，为神经嵴（neuralcrest）。在神经管形成的同时，胚体内的其它部分也在发生变化，而且是彼此协调进行的。重要的变化有：1、由于神经管的形成，神经外胚层完全与其他外胚层分离。神经层较厚，它由长柱形细胞组成，表皮外胚层较薄，其上有色素。2、脊索与其附近的中胚层完全分离，呈圆棒状。两侧的中胚层渐渐向腹部延伸，最后形成体节中胚层（segmentalmesoderm）和侧板中胚层（lateralplatemesoderm）。3、在胚胎前端的原肠腔腔较大，构成原肠壁的内胚层较薄；越往后原肠腔越狭窄，原肠壁越厚。原肠腔即形成管状的原始消化道（digoetiveduct）。观察蛙的神经胚切片标本，注意观察神经管的形成过程，并区分脊索、原始消化道、中胚层、内胚层及外胚层。二、蛙的尾芽期：观察蛙的尾芽期胚胎外部形态和纵切片，可以说明脊椎动物体型的主要特征。神经管的前端膨大形成脑。三个原始膨大区：前脑（prosencephalon）、中脑（mesencephalon）和菱脑（rhombencephalon），为所有脊椎动物胚胎神经管的头部特征。前脑的两侧凸起形成视泡（opticvesicle）是一对眼睛的视网膜原基。在菱脑的两侧表皮外胚层向内凹陷并加厚形成听泡（oticvesicle），它将来形成内耳。所有脊椎动物胚胎的另一显著特征是口窝和肛窝。口窝是外胚层的浅窝，它与消化道的最前端内胚层的口突相遇形成口板，将来破裂形成口。在尾的基部有一个外胚层的凹陷，即肛窝，它将穿孔通到消化道的后端，形成肛门或泄殖窦。观察蛙尾芽期胚胎的连续横切片，注意观察切经视泡、听泡、中肠与肝脏原基的切面，了解其内部变化。1、神经管的分化，除了前述外，在口窝向上方突起形成垂腺（hypephysis），与前脑的底部向下突起形成的漏斗腺（infandibulum）合并为脑垂体（pituitarybody）。37\n2、中胚层分化，躯体的中胚层向两侧和腹面延伸，在腹中线相遇，由背到腹面分化为体节中胚层和侧板中胚层。体节中胚层将来形成体节。侧板胚层分化成内外两层，内层为脏壁中胚层（splanchnicmesoderm），外层为体壁中胚层（somaticmesoderm）。居于二者之间的腔隙即为体腔（coelom）。3、内胚层的分化，原始消化道已分化为前肠（fore-gut）、中肠（mid-gut）和后肠（hind-gut）。前肠膨大，其左右两侧有成对鳃囊（gillpouch）突起，前肠的腹面向后方突出一个盲囊状的构造，为肝脏（liver）的原基。中肠的顶壁较为狭小，而其底壁特别厚而富含卵黄。后肠此时仍为神经肠管，其下方有肛板（analplate），后破裂为肛门。三、蛙的孵化期：孵化期的蛙胚已脱离其外围的卵胶膜，孵化为蝌蚪（tadpole）。刚孵化的蝌蚪体长大约为5-6mm，各器官构造进一步发育。1、观察5-6mm蛙胚的矢切面：神经系统此时前脑已分化为端脑（telencephalon）和间脑（diencephalon，从前脑背面一横褶至横隆起做一平面，前者是端脑，后者是间脑。间脑背壁有一突起为脑上腺（epiphysis）。在间脑后端，向腹面突出是漏斗，已与拉克氏囊联合构成了垂体（pituitarygland）。中脑仍为圆筒状，菱脑分化为后脑（cerebellum）和延髓（myelencephalon），其特点是顶壁较薄。延髓之后连接着细长的脊髓。在神经管的腹面，有一较长的泡状化的细胞带，即为脊索。消化系统在咽前端头部腹面，外胚层向内凹陷，此为口窝，它与咽部内胚层相连接处称口板。在胚胎前端腹面膨大的腔即是咽（pharynx），咽腹壁向外有一突起为甲状腺。与咽相连的为前肠，前肠腹后方继续伸长的即肝突。前肠后部的细长管道为中肠，与中肠相连的后段是后肠，此时后肠末端的肛门已开口。循环系统在咽腹面有一较大的腔，为围心腔（pericardialcavity）。其内为心脏，此时的心脏已分化为动脉干、心室（ventricle）、心房（atrium）、静脉窦等四部分。动脉干在心室的前端背面，腹面为膨大的心室，心室的背方是心房，心房之后的薄壁腔是静脉窦。2、观察5-6mm蛙胚经鳃弓的额状面：37\n在头的前端有一对凹陷处为嗅窝。头部的腔为端脑。位于脑后段的大腔即为咽部。在咽的两侧，可看到六对的鳃弓（visceralarch)和动脉弓，在咽的两侧向外突出部分是外鳃（externalgills），咽后段是细长的消化道，消化道末端是泄殖腔。在中肠的两侧有许多盘曲的小管为前肾小管（pronehrictubules），前肾管呈长管状。3、观察5-6mm蛙胚横切面：切经嗅窝的横切面：切面中央的腔是间脑，间脑背壁呈圆球形突起的是脑上腺。切面腹部中央之凹陷是口窝，在口窝两侧向内凹陷即嗅窝（olfactorypit）。切经眼的切面：切面中央的腔为脑，其靠近背部的脑为中脑，靠近腹部的脑为间脑，想一想为什么两个脑腔会在一个平面上。在脑壁两侧向外突出物为视杯（opticcup），圆球形的晶体位于视杯口中。视杯与间脑连接处为视柄（opticstalk）。间脑腹面有一团细胞即垂体。间脑腹部的空腔为咽。咽两侧有许多分散的间叶细胞。切经听泡的横切面：切面背部是背壁薄侧壁厚的后脑，后脑之下是脊索，脊索两侧呈椭圆形囊的是听泡，听泡背面突出一小管为内淋巴管（endolymphaticduct）。后脑两侧呈薄壁的血管为前主静脉，在咽背面有两条薄壁血管是背主动脉。脊索腹面的大腔是咽。在咽腹面的腔是围心腔，其中见有心室和心房否？胚体两测向外突起的是外鳃（exteranlgill）。切经肝脏及前肾的横切面：背部是脊髓，其两侧的细胞团是神经嵴。在脊髓的腹面是呈空泡化的脊索。位于脊索两侧的密集细胞团是体节。在体节腹面的血管是前主静脉。位于脊索腹面的两条血管即背大动脉。消化道位于脊索的腹面，肠腔较狭窄，为中肠。在中肠之下的空腔是肝突，在肝突的两侧，有两个膨大的血管是卵黄静脉，其内充满了血细胞。前肾位于体节的腹面，可看到几对前肾小管。37\n实验八蛙的人工催产及体外跌卵实验一、实验生物同实验五二、实验材料与实验仪器实验材料：蟾蜍、性成熟雌、雄泽蛙。实验仪器：解剖器、注射器、培养皿、玻缸、广口小瓶（50ml）、玻璃小钩、玻璃匀浆器、双目解剖镜。三、实验内容（一）蛙的人工催产1、亲体的选择：春末夏初，正是多种两栖类的生殖季节。蟾蜍（Bufomelenostius）、泽蛙（Ranalimnocharis）、虎纹蛙（Ranatigrinarugulose）和黑斑蛙（Rananigromoculata）等都是常见的实验材料。其中泽蛙分布广，生殖季节长，群体中从4月初至9月上旬都有成熟的个体，个体生殖频率为3次，最高可达6次，是发育生物学研究的好材料。为了能按照我们的意图随时获得受精卵，从野外采集亲体时就要将雌雄隔离，在室内分养。雄性个体精巢中整年都有精子。人工催产时注意对雌性亲体的挑选。雌蛙卵巢的成熟度可分为不够成熟、适当成熟、过度成熟及退化卵巢。蛙的腹肌甚薄，可以用眼科剪将后腹侧的皮肤剪一小口，然后透过腹肌观察卵巢成熟度：适当成熟卵巢分叶中大部分卵粒大而饱满，黑色素明显，动、植物半球分明。未成熟卵粒大小相差很多，黑色素不明显，动、植物半球不分明。过度成熟卵粒表面无光泽，开始解体或被吸收。退化卵巢整个卵巢呈灰色或花斑状，卵粒小，卵巢上的脂肪体尤其发达，这种卵巢当年不会再排卵。37\n将卵巢已适当成熟或接近成熟的雌蛙选出放在广口玻缸中加盖备用。2、催产：取LRH类似物（LRH-A，宁波激素制品厂出品）按每只雌蛙5-10微克的剂量进行腹腔注射。为了防止注射液回流体外，注射针头可由大腿肌肉插入，穿过腹腔（稍挑起，以免刺伤内脏），然后徐徐将液体注入腹腔。注射完毕后，给每缸加些清水待其排卵。雄蛙一般不必注射激素。催产后的排卵时间与温度的变化有关。在室温18-22℃内须16-24小时后排卵。若将温度提高到25-28℃，则可在5-6小时后准时排卵。3、人工授精：首先制备精液。取雄蛙一只，迅速杀死后取出一对精巢，置于盛有少量Ringer氏液的培养皿中，用镊子捣碎精巢，释放出精子。精液制备后立即通过“压挤”方法将雌蛙的卵子从泄殖孔挤出，置于精液内，稍加搅拌，加入些井水。静置2-3分钟后，再加井水并洗去多余的精子及精巢碎片。人工授精后大约10分钟卵子出现“翻正”现象，带有黑色素的动物极朝上，乳白色的植物半球朝下方。一眼看去，卵子表面呈现灿烂的青色，表明卵子已受精。如果卵子授精后迟迟未翻正，则没受精，须探讨原因。所得的活胚胎可进行早期发育观察，或进行其他科学研究。（二）蛙的体外跌卵蛙的体外跌卵实验可与蛙的人工催产同时进行，以便进行体内跌卵与体外跌卵的比较。实验可选3只雌蛙分3组进行，每组取三块卵巢，分别与脑垂体悬浮液、LRH-A和Ringer氏液作用。同时选数只雌蛙腹腔注射这二种激素和Ringer氏液作对照。实验方法如下：1、取9个广口瓶，每瓶内盛48mlRinger氏液，然后摘取18个蟾蜍脑垂体配制成6ml的悬浮液，取其中3瓶分别加入2ml脑垂体悬浮液；另取3瓶分别加入2ml的LRH-A稀释液（含20微克）；剩下的3瓶不加激素仅盛有50ml的Ringer氏液作对照。2、取337\n只成熟雌蛙，剖开腹腔，各取出一侧卵巢。经过检查认为是适当成熟的，然后放在生理盐水中洗去血污，用解剖针轻轻地从卵巢中分出三小块，每块大约100粒卵子。然后用线或玻璃小钩悬挂于预先准备好的3组小瓶中，让液体淹没卵巢，实验手术就此结束。3、离体卵巢与激素接触约1小时后，便可以开始观察跌卵的情况。注意各组中的变化，记录第一个卵跌落的时间，以后每隔1小时观察一次，计算跌卵数。并与活体内的跌卵进行比较。在3组中可以看到无论活体内或离体卵巢与含脑垂体的液体接触都可跌卵。并随着接触时间的延长而加快。离体卵巢在与激素接触的最初1-2小时即开始跌卵，但活体内无反应。在接触10小时以上，活体内的卵巢中几乎无大的卵，已全部跌光，但离体的一般只能跌出2/3。至于跌出的卵是否成熟，可检查卵的动物极上是否有一灰白色小区域―极区。极区的出现表明卵已在进行第二次成熟分裂，成熟卵呈圆球形，卵质的胶粘性较强，表面无凹凸或皱褶。反过来，有些卵虽然跌出卵巢，但是动物极上没有极区，卵表面多凹凸，胶粘性不强，即未成熟卵。离体卵巢与LRH-A稀释液接触未能跌卵，而在体内跌卵正常，试通过激素调控机制说明之。那么仅与Ringer氏液作用的情况又是如何呢？ 实验九鸡卵的人工孵育和胚胎发育观察37\n一、实验生物鸡胚作为生物学的实验材料，其历史已经相当悠久。鸡蛋取材方便，孵育条件简单，且一年四季都有新鲜材料可取，是胚胎学、发育生物学教学、科研的良好材料。近代，鸡胚已被大量地用于发育的研究。鸡胚的壳外培养方法，最早见于Schlesinger（1966）的报道。当时只能使鸡胚存活10-12天。经过近二十年来许多学者的努力，现在已能使鸡胚在无壳情况下存活和正常分化至第15天左右。目前鸡胚无壳培养方法大体上有聚乙烯小袋法、塑料皿培养法及玻璃小杯法和玻璃皿培养法等。其基本原理及方法大同小异。有关鸡胚研究的历史可以追溯到Aristotle时期，并包括科学史上一些伟大人物，如Harvey,Wolff以及其他的许多科学家。近代，鸡胚已被大量的用于发育的研究，可以肯定地说，鸡胚发育是所有生物体研究最深入的一种。对鸡胚发育的形态模式的兴趣，远远超过鸟类个体发育的基本描述，因为早期鸡胚发育和哺乳类胚胎发育之间有明显的相似之处，而哺乳类胚胎较难获得。鸡的个体发生中，许多早期发育如受精及卵裂过程并没有象蛙胚那样观察得如此清楚。困难的原因之一是鸡“卵”结构的特殊性。卵子（通常称卵黄）在排放过程中被雌性生殖道分泌的产物所包围，它包括蛋白或蛋清、壳膜和卵壳。所有这些附属层是在卵受精以后加上去的。卵本身是一个大的多卵黄的细胞，有限的细胞质区在胚盘，其中包含细胞核。卵裂只在胚盘上进行。当鸡蛋产出时，胚胎发育已处于原肠期（原条形成期）。随着温度的降低，发育停止。只有将蛋放到孵育温度下才能继续发育。二、实验材料与实验仪器实验材料：鸡胚装片，共8片：24小时鸡胚装片，24小时鸡胚连续横切，48小时鸡胚装片，48小时鸡胚连续横切，72小时鸡胚装片，72小时鸡胚连续横切，96小时鸡胚装片，96小时鸡胚连续横切；受精鸡蛋。37\n实验仪器：孵蛋箱、检蛋灯、解剖器、解剖镜、温度计、湿度计、小碗、培养皿、光学显微镜等。三、实验内容（一）观察鸡胚切片观察24小时至96小时鸡胚的整装片和横切片，掌握在鸡胚发育的不同时段的组织结构，并与前面进行的几个实验海胆、文昌鱼、斑马鱼、蛙等的胚胎发育纵向对比，探讨在进化过程中组织器官的发育演变。（二）学习鸡卵的人工孵育及其注意事项孵育是鸡类繁殖采用的方式，它保证了胚胎正常发育必须条件。人工孵育就是运用自然孵育规律，以人工的方法，满足胚胎发育不同时期的生理需要，使之得到良好的孵育效果。1、孵蛋箱结构及使用方法：目前国内各地所使用的电热孵蛋箱，虽然各种型号不同，但基本结构原理是相似的，均有加热的电热丝，利用金属热胀冷缩的原理控制电路的通断，以达到调节温度的目的。温度调节旋钮一般装在箱外。箱内设有蛋架、出雏盘、温度计、湿度计、盛水盘和照明灯。有的孵蛋箱装有可调空气流量的通气窗，及调匀温湿度和空气用的电风扇。此外有的孵蛋箱还设有转蛋装置。孵蛋前几天，将孵蛋箱擦净后，再用来苏尔、或过氧乙酸、或70%酒精消毒灭菌。然后接通电源，打开气窗，转动调温旋钮，将温度调节到37-39℃。再将同1%HCl浸洗冲净的砂粒放于盛水盘中，加入适量蒸馏水，使箱内湿度达到50-60%的相对湿度。待温湿度稳定2-3天后，即可使用。2、受精蛋的选择和保存：为保证较高的孵化率，必须对蛋进行选择。最好选用刚产出一周以内的蛋。蛋的形态要正常。过圆、过长或畸形蛋都会影响孵化率。蛋壳的厚薄要均匀一致。壳上具凹凸不平条纹的蛋，也不宜使用。用照蛋灯检查时，要选气室小，无裂纹，卵白浓稠的蛋。卵黄浮起，卵黄破散，蛋内有黑点或血块的蛋均不能使用。37\n蛋的保存很重要，蛋产出后最好保存于10℃左右。保存环境相对湿度应为75-85%。湿度低，蛋内水份易蒸发，湿度高，蛋易发霉。温度超过20℃时，受精蛋易自行发育，低于8℃时，蛋的孵化率也受到影响。蛋的保存不宜过长，通常以10天为限，10天以上孵化率可能受影响。3、孵育前蛋的消毒及升温处理：入孵前将蛋从10℃冰箱中取出，先放在20多度的室温下平衡温度3-4小时，使之逐渐升温，再用温水（30-40℃）浸洗干净蛋壳上的污物。便可按孵蛋框大小或实验要求的数量立即放入孵蛋箱中。每个蛋壳上要用铅笔注明日期，作好记录。4、孵育的日常管理：孵育管理是保证鸡胚正常发育的外界条件中的重要环节。外界条件主要指孵育温度、湿度、氧气的供应与转蛋等。氧气的供应，应该随孵育时间而增加，通气窗也应随孵育的进程而开大。（1）转蛋：鸡蛋孵育时，胚胎浮于卵黄上面，如果不随时转蛋，胚胎易与蛋壳粘连，影响出壳。为了防止粘连，每天需转蛋四次。转蛋角度45-50度。转蛋还可使蛋受热均匀，起调节局部温度的作用。（2）检蛋：为保证孵育成功，还应该经常检查胚胎发育情况（图10.3）。一般每批蛋要定时检查2-3次，通常在5-6天，10-11天和17-19天。检蛋用照蛋箱，照蛋箱可用自制的长方木盒，内装60-100W的灯泡，在盒的一面挖一略小于蛋径的椭圆形孔。检蛋通常在较暗的条件下，或在晚上进行。检蛋时，将鸡蛋放置孔内，慢慢转动，即可见卵黄上有一小胚胎。第一次检蛋的目的是检查蛋的受精情况（图10.2），及时查出不正常和未受精的蛋，以及死胚蛋、散黄卵等。正常蛋发育5-6天时，血管分布如蜘蛛网，颜色发红，卵黄下沉。无受精蛋此时与未孵育蛋一样，蛋中透明，卵黄呈桔黄色，悬于卵白中。散黄卵中，昏暗一片，见不到圆形卵黄投影或卵黄飘悬，呈不规则状，也见不到血管。死胚蛋中，混浊，可见血环、血弧或血点。但无清楚的血管。或胚胎模糊不清，死胚一般不动。发育不正常蛋中，可见胚胎发育迟缓，如弱胚蛋或保存时间过长或保存温度过低的蛋常发育不正常。37\n第二次检蛋目的是检出中途停止发育的胚胎。正常发育的蛋此时除气室外，卵蛋布满血管，呈均匀黄色。鸡蛋尖端也有血管明显分布。如鸡蛋中出现黑影，并可随人转蛋而转动，周围无血管或血管模糊，蛋白混浊不透明，颜色变暗发黄不呈红色，或胚胎发育明显小于正常，这都说明胚胎已停止发育或已死亡。第三次检蛋目的是检出不正常发育的蛋，同时为孵化出壳做准备。正常蛋此时气室下缘呈波浪状，鸡胚颈部突入气室，使气室下缘的壳膜忽上忽下闪动。如果胚胎停止发育，则血管模糊不清，近气室部分不象正常蛋为红色，而常变成黄色。如将鸡蛋放于眼皮处无热感，说明胚胎已死。第三次检蛋后，将蛋的大头向上呈45度倾斜竖放。此后羊膜与尿囊中的液体渐渐减少。鸡胚啄伸向气室。竖放对出壳有利。（三）掌握鸡卵的人工孵育技术和鸡胚发育的一般过程（1）孵育48小时的鸡胚发育观察1、取孵育48小时的鸡蛋，轻轻摇动后放在小培养皿中，蛋下垫以棉花或软纸作成的垫圈使之稳固。用镊子尖端在蛋的钝端气室处打一小孔，让空气逸出。这样卵黄就下沉离开蛋壳内表面。然后用镊子从气室开始，慢慢剥去蛋壳，直至卵黄完全暴露为止，然后将卵倒入盛有39-40℃的0.85%生理盐水的小碗内，使胚胎朝上。2、用尖头镊子轻轻剥离胚胎上复盖的蛋白，使胚胎暴露。然后用尖锐的尖头剪刀沿胚盘外缘周围剪开，并速以左手执小铲从剪开处插在胚盘下托起，然后再将胚盘完全剪开，胚盘下也要剪一刀，胚盘就可以脱离卵黄，然后将胚盘用小铲移至盛有0.85%生理盐水的小培养皿中。然后取一尖头镊子夹住胚盘边缘，在水中轻轻摆动，吸去胚盘下面的卵黄。这样多洗几次用吸管吸干培养皿内的生理盐水，将胚盘平贴在皿底。3、将胚盘置解剖镜下进行观察。孵育4837\n小时的鸡胚胚体头部较大躯体已演变成圆柱形，中脑处发生头曲，使头部倾向于右方，稍向后弯曲。脑部已分化成端脑、间脑、中脑、后脑及延髓五部分。眼和耳已形成。视泡位于间脑的两侧，已呈双层视杯构造，外层为网膜层，内层为色素层，晶体也已形成。延髓两侧背方外胚层增厚凹陷形成听泡，因头曲的关系听泡位于视杯同一水平。在耳右方与主动脉球左方之间，前肠二侧壁上具有三对的鳃沟。胚胎的循环系统已明显。心脏在有规律地跳动，心管弯曲扭成“S”形，心室在左边，前接主动脉球，心房在右边，后接静脉。观察胚胎在胚盘上的血液循环，可见有卵黄静脉和卵黄动脉否？其间分支有无数毛细血管弥散于血管区中并与血窦相连。将解剖镜小心地聚焦于血管上，如胚胎还活的话，辨别血管内血流的方向和速度。血液从胚胎的动脉流出，而由静脉流进，动脉中的血流显得起伏搏动，而静脉血流较为平稳和匀称。观察胚体的体节数，体节位于脊索的两侧。此时已有几对体节。（2）、鸡胚晚期发育的观察观察孵育6-7天、16-17天的鸡胚。同上法将要观察的鸡胚小心从蛋壳中取出置于盛有生理盐水的培养皿中观察之。孵育7-8天的鸡胚左侧卧于卵黄囊上，胚体外被以透明的羊膜（amnion），其上覆以具血管丰富的尿囊绒毛膜（chorioallantoicmembrane）。注意这三种胎膜如何分辨。观察卵黄囊是否全部包住卵黄。卵黄之下有淡黄色的浓稠卵白及稀的无色透明卵白。观察孵育16-17天的鸡胚，注意卵黄囊、尿囊及羊膜的形态有否变化。在每期观察胎膜关系后，剪开羊膜，仔细观察胚体外形。注意肢芽的发育，羽毛的形成，身体各部分相互比例的变化。（3）、鸡胚在孵育过程中的发育1、第1天，鸡胚的雏形隐约可见，最初是消化道、脊索，然后是神经系统，头、眼、血岛开始形成，胚盘长约0.7cm，但验蛋时不易辨认（图10.4）。2、第2天，神经管及前、中、后脑形成，心脏形成并开始跳动，血管出现。胚盘长约10cm，验蛋时可见在卵黄阴影中有一小黑点，血管和心跳尚看不出（图10.5，10.6）。3、第3天，胚胎约长0.55cm，卵黄囊、羊膜和浆膜出现，卵黄囊血管内径大1cm，胚胎的鼻、翼、后肢开始形成，尿囊亦开始出现，验蛋时可见卵黄上有一小黑点及血丝（图10.7）。4、第4天，胚胎长0.77cm，卵黄囊血管包围卵黄约达1/3，胚体各器官已基本具备，胚胎形态与哺乳类相似（图10.8）。37\n5、第5天，胚胎继续增大，长达1cm，已具有鸟类的外形，头弯向胸部，雌雄分化，尿囊发达，与卵壳膜靠近，验蛋可见心跳，翻蛋可见一透明囊，即为尿囊。6、第6天，胚胎长1.38cm，啄形成，卵黄囊血管包围卵黄2/3以上，翅与腿的构造可区别出来，验蛋时可见胚胎有收缩（羊膜的收缩）（图10.9）。7、第7天，胚胎长约1.42cm，尿囊急剧增大，与浆膜相贴并愈合，形成尿囊绒毛膜。眼增大，脚上已长出脚趾。8、第8天，胚胎长1.5cm，羽毛出现，胚胎的肋骨、肺、胃、肝明显。9、第9天，胚胎长2cm，开始角质化，尿囊几乎包围整个胚胎。10、第10天，胚胎长2.1cm，尿囊绒毛膜在卵的小端合拢，脚趾明显，整个背部、颈部和大腿有羽毛乳头。11、第11天，胚胎长2.5cm，眼脸几乎达于瞳孔，头部和翅上长出羽毛，腺胃可清楚区别出来。12、第12天，胚胎长3.57cm，啄上分出鼻孔，全身复有长的绒毛，肾脏开始工作。13、第13天，胚胎长4.34cm，头上复有绒毛，在眼的周围也长出羽毛芽。14、第14天，胚胎长4.47cm，完全复有绒毛，胚胎以横着的位置改变为与长轴平行，头向气室。15、.第15天，胚胎长5.83cm，眼瞳盖住眼睛，胫部及脚趾上鳞片形成。16、第16天，胚胎长6.2cm，头上的冠和肉垂已很明显。17、第17天，胚胎长6.5cm，啄上的鼻孔已经形成，羊水和尿囊液已开始减少。18、第18天，胚胎长7.0cm，胫部及脚被鳞片复盖，眼睛睁开，羊水和尿囊液明显地消失，啄已朝向气室。19、第19天，胚胎长7.3cm，剩余的卵黄，自肚脐处入体腔内，尿囊动脉、静脉退化萎缩，胚胎头向蛋的钝端，啄穿入气室开始呼吸，头夹左右翼下，两腿弯曲朝向头部，以便于破壳时挣扎有力，胚胎头部肌肉特别发达，便于帮助破壳，验蛋时看到壳内胚胎呈黑色，除看到胚动外，还可在气室下看到粗的血管。贴耳细听，有时可听到雏鸡的叫声。20、第20天，胚胎长80cm，开始破壳，尿囊萎缩，雏鸡可见，在壳内有叫声。21、第21天，雏鸡孵出。37