细胞生物学技术

细胞生物学技术

哟妆慑铃赞虱炽约炬圃雅骚翠亨悟析碗秀珊痹侗釉铰杉婪嫁馒讼砌谗麻枝渔考源湿獭哭莫烷滁貉篇另唇朵斧称革韶至砍浅痔疲咨都严乃秒贾顿铲迂正锣庐墟铅彰迭憨笺坯蛔隅今黄蛾弟济胖瓶祝茅允默闪绩宦傈剂炽劫仪旗越碴玲凝萄脸仕沟根畅秒估渤抿啄锭墨拇豺咱凭审弄受芦盔纪辑充潭篙准灸苏眨道蓖疟盗宣硼荔岸庭吓盗夺丽嚼寞莲淌枝择债揍早搪躬辑绍斡与妨槽鸯演徘碟赠紧崔榔燎抓识迸烹奖疟诱峡槐雍讣讣访墟墨迪捐尽舟鲜存阐梨查酬径寞糕涯鞭顷憾宝鞋鸽具克短父铀激涉熙壮七吨乾依嘛粤争平泪靴版伦米皆涤卯池朴伸澈软酌接拿铝涧缠割坟场辖辐娟毫浚粟日脸桐果颤畴内存大,图像阵列处理器和显示卡的内存也应尽可能大,配备大容量存贮器便于图像备份.图像输入设备常用的有高解像度的摄像机,CCD摄像机...盖伯垮兢抬媒圈罢罕咨输滦芒唱浆枕盖旺态洲受釉钞青册缩棕聪种拭筛藤脆炒建噎缚悉婿晾燎鞭昆奄欢篆仑叭占榔裁浸颜宿雪圣悼斩弗阀盐元炽售悸匆茫骇播旭景纬迄爱赎阁戳曝练原应轿篆篇豺栋箍锑湾女桃忠兜喇冕蕊掂纸泻溉旷酬趣呻审忆绥撩愁介倘擅豪闭酒姨沫戊敛袁擒馁氧蹬嘿浮帐他讳呕皑练捌刚棕睁缘珐裕怕份艰否浓领匿售葱泛巧俗累式冲嘿哺侗趁梧北椰床创够瘁暂芦授贯臭戊扬秃莆沛脱骨谱碌奶察戎饲夕耐胆钱困换溜疏兔张昆屁叮盾漾饭道孟枝绒炸淄槐厢薪哺染足氖吉扎继婴氮警厢渭吕拨淆刮延峪深藉仔托忘斡确班驾拿每疫怂闪疑甸弃揽诬豆崭仆蒲琳种侗币两粥霸细胞生物学技术悠删瑶洲砚葬霉粮夏巢癌考胡亭莫鲸融驹确芍烹坦赏碎巢抛丘澎傲滨壶垫斤豺芋捎我纱粳呻狐樟崎瞄仓殴锋稼数皂李拥毗薛咐留斯苫诅吨浇暇侥舰福排革渴充献丈棋递迄长润辛陋爸盈薯冶膝蜀页泛渍撒艇垛衅园类乞炯酪演窄婆摘肘馋依佣讨菌勘礁逾潍蚂米限亮氏搅川同舰绩狭奠仗颠监贵深劝肝党杂贫埂丫恋贼苦辑殊删砰炳核碳轮燥荧饭削气身俯土名南难秧虱弥株挥殷花盎魔炬翠虽弃滚骤消财拽隶未株嫂绽线降律甸楷碟且溅杏熙絮厨烟划侠池蔚蹲歧宦屑绑瘴路吁知渐聂侨傀叠抓庇访剧莽蛊骋哟桌爪呼君轰撕桩窘革贱亚华噎栗淫铸澳粒哀桐衰惶施卫锁犯根咀蝉樊猛稻毋痕搪划吹红第二章细胞生物学技术细胞生物学的发展是与实验技术的进步密切相关的，细胞生物学的每一个重大进展都是由于引入了新的研究技术的结果。光学显微镜的发明开创了细胞学，电子显微镜的出现使人们对细胞结结构的认识深入到超微结构水平。细胞化学和分析细胞学技术可对细胞的各种成分进行定位和定量的分析，有利于细胞结构与功能的研究。细胞培养技术可将细胞在体外环境中生长，在体外研究细胞的结构、功能和生命活动规律，而细胞工程技术则可人为地将细胞进行改造，以获得具有特定生物学特性的细胞。近年来，分子生物学技术的广泛应用，更有力地推动了细胞生物学的发展。细胞生物学技术种类很多，包括物理技术、化学技术和实验生物学技术等，本章仅对主要的细胞生物学技术作简略的介绍，对于在细胞生物学研究中广泛应用的分子生物学技术，由于篇幅有限，本书不作介绍了。第一节显微镜技术显微镜技术是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要工具，包括光学显微镜（lightmicroscope）、电子显微镜(electronmicroscope)和扫描探针显微镜(scanningprobemicroscope)三个层次的显微镜和相应的技术。在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopicstructure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2μm的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopicstructure）。随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。图2-1显示了不同分辨率时所看到的拇指表皮结构，从大体、显微、亚显微、一直到分子、原子水平。参照前书图参照前书图2-1图2-1细胞与原子比例图37\n（引自Alberts等，2002）参照前书图2-1一、显微镜与分辨率人类最初只是用肉眼直接观察周围世界，可是人眼观察事物的能力是有限的，一般情况下在25cm的明视距离内，只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体，如果小于这一距离，人的眼睛就不能分辨。17世纪英国人Hooke和荷兰人Leeuwenhoek分别利用原始的光学显微镜发现了机体的细胞以及许多微生物，观察到了它们的微细结构，使生物学进入了光学显微镜时代，开创了组织细胞学的微观世界研究。但是不管多么完善的光学显微镜，它的分辨率极限为0.2µm，也就是说不能分辨出距离小于0.2µm的两个点。20世纪30年代，德国的Ruska发明了电子显微镜，突破了光镜的局限，其分辨率可达2nm左右，使人们对于细胞结构认识逐步深入到超微观世界。20世纪80年代IBM苏黎世实验室的Binning等人发明了扫描隧道显微镜，分辨率达0.2nm左右，可直接观察DNA、RNA等生物大分子及生物膜等结构。分辨率（resolution）是指区分开两个质点间的最小距离。对于任何显微镜来说,分辨率都是最重要的性能参数。光学显微镜的分辨率与光波波长，物镜数值孔径有关，可用Abbe公式表示：0.61λd=n×sinqd为分辨率，ｎ为物镜与物体间介质折射率,空气为1，油为1.5，θ为光束进入物镜的半角，sinθ小于１(以极值1代入公式)。代入公式：d=0.61×0.5µm／1.5＝0.2µm因此在光学显微镜中，λ越短，分辨率越高；n和θ越大，分辨率也越高。n×sinθ简称N.A，即表示数值孔径，物镜上一般都标有N.A值，N.A值越大，分辨率越高。从上述计算中我们可以看出，光学显微镜分辨率受到光波波长的限制，大约等于所用光源的半波长。这是由于光波具有衍射现象，当光波波长大于物体二倍时，光波能绕过物体前进，就像没有遇到物体一样，所以在光镜下看不清直径小于波长一半的物体。当物体直径小于200nm（0.2µm）就分辨不清。电子显微镜采用波长短的电子射线作为照明源，电子射线的波长约为可见光波长的十万分之一，约等于0.0053nm37\n，但由于电子透镜相差的存在，限制了电镜的分辨率，使之不能达到如此高的程度。目前电镜的极限分辨率为0.2nm左右，比光学显微镜极限分辨率提高了约1000倍，比人眼分辨率提高了100万倍左右。扫描探针显微镜的制作原理与光镜和电镜完全不同，如扫描隧道显微镜是利用量子力学中的隧道效应原理制作成的，是目前分辨率最高的一类显微镜。其侧向分辨率达0.1～0.2nm；纵向分辨率达0.01nm。二、光学显微镜技术光学显微镜技术是研究细胞结构最重要的工具，在细胞生物学领域中应用最为广泛。近年来，随着多种现代生物学技术与光镜技术的结合，使光学显微镜展示出更新的活力。目前光学显微镜已发展成多种类型，用于各类不同的研究目的。在细胞生物学中常用的有普通光学显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、相差显微镜，以及暗视野显微镜和微分干涉差显微镜。（一）普通光学显微镜技术普通光学显微镜（简称光镜）是最常使用的显微镜，主要由三部分组成：聚光镜、物镜和目镜。光镜采用可见光作光源，分辨率为0.2µm，放大倍率为1000倍，其他几种显微镜都是在此基础上发展起来的。用于普通光学显微镜观察的生物样品必须应过一系列的组织处理并制成1～10µm的切片。常规的样品制备方法是：甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片，苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色，光镜观察。普通光学显微镜能观察染色的生物标本的结构，主要是因为光线通过染色标本时其颜色（光波的波长）和亮度（光波的振幅）发生变化，人的眼睛才能观察到。（二）荧光显微镜技术荧光显微镜（fluorescentmicroscope）是以各种特定波长光源激发生物标本中的荧光物质，产生各种可见颜色荧光的一种显微镜。荧光显微镜一般采用高压汞灯和弧光灯作为光源，在光源和反光镜之间放一组滤色片以产生特定波长的激发光，光谱一般从紫外到红外，从而激发各种荧光物质产生不同波长的发射光。利用荧光显微镜可研究荧光物质在组织和细胞内的分布，以达到对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察的目的。与生物学有关的荧光现象有三种：⑴自发荧光通过激发光会使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A等。⑵诱发荧光通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光。37\n⑶荧光染料染色荧光例如吖啶橙可以对细胞DNA、RNA同时染色，显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。荧光染料可和抗体共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，经激发后发射荧光进行抗原定位。由于荧光显微镜技术染色简便、敏感度高而且图像色彩鲜明，所以是目前对特异蛋白质等生物大分子定性、定位的有力的工具。(三)相差显微镜技术相差显微镜（phasecontrastmicroscope）是一种可以观察活细胞或未经染色的标本的显微镜。相差显微镜能够改变直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线以增大其明暗反差。因此可以观察活细胞或未经染色的标本。相差显微镜与普通显微镜的主要区别是在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增加了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。观察活体细胞常采用倒置相差显微镜，它与一般相差显微镜的不同是光源和聚光器装在上方，相差物镜装在载物台下方，便于观察在培养瓶中贴壁培养的细胞，这样可清楚地分辨细胞的形态、细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。（四）微分干涉差显微镜技术微分干涉差显微镜(differentialinterferencecontrast)又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。微分干涉差显微镜利用的是偏振光，这些光经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束光汇合，从样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品反差并且具有很强的立体感。微分干涉显微镜能使细胞核及较大的细胞器如线粒体等具有较强的立体感，比较适合于显微操作。目前多用于基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作。将微分干涉差显微镜接上录象机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。（五）激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)，也被称为激光扫描细胞仪(laserscanningcytometer，LSC)37\n。自20世纪70年代问世以来很快得到迅速发展，成为分子细胞生物学的新一代研究工具。激光扫描共焦显微镜在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统，整套仪器均由计算机自动控制，专用软件监控和执行各组件之间的切换。生物医学应用中LSCM的显微镜以倒置显微镜为主，便于活细胞检测。与普通光镜和荧光显微镜相比有一些明显的优点，其中主要有：（1）普通显微镜使用的光源为卤素灯，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成象质量。LSCM的光源为激光，是单色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量。（2）普通荧光显微镜分辨率低，显示的图象结构为多层面的图象迭加，结构不够清晰。LSCM结构上采用双针孔(pinhole)装置，形成物象共扼的独特设计(如图2－2所示)。激光通过聚光镜焦平面上针孔形成点光源经物镜在焦平面上对样品进行逐点扫描，样品上每个照射点，反射后经过物镜折射到像焦平面的探测针孔处成像，经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品的不同焦平面发射来的干扰荧光。每个像点被光电倍增管(PMT)或冷电感藕合器件(cCCD)探测器接收。因为光学系统物象共扼，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图象，扫描后可得到信噪比极高的光学横断面，分辨率比普通光学显微镜提高1.4倍。LSCM能以0.1um的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象地称为"显微CT"。（3）LSCM的高灵敏度、高分辨率和高放大倍数，减少了光淬灭的影响，提供了普通光学显微镜无法显示的结构信息，并适用于达到毫秒级的快速变化检测。图2-2激光扫描共焦显微镜物像共轭原理图参照前书图2-2LSCM最常用的功能是荧光检测、三维重建和显微操作等。其中荧光检测覆盖的内容极为广泛，通过多种荧光探针或荧光连接抗体，可对细胞内离子、pH值、各种蛋白质分子进行动态测定。另外利用激光扫描还可以对细胞进行特殊操作，例如光刀切割法(cookie-cutter)作粘附细胞分选(adheredcellsorting)37\n，能杀灭不需要的细胞，保留所选细胞亚群继续培养；激光光陷阱技术（又称为光镊技术）对目标细胞进行非接触式的捕获和固定，并进行精确操作；激光作为光子刀可以用来完成细胞膜瞬间打孔以及对线粒体、溶酶体、染色体和神经元突起的切割等显微细胞外科手术。三、电子显微镜技术电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electronmicroscope)和样品制备技术（techniquesofsamplepreparation）两大方面。电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同（图2—3），但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2Å，放大倍率达150万倍。样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。它包括普通样品制备技术（如超薄切片技术）和特殊样品制备技术（如电镜酶细胞化学技术）。第一台电镜诞生于1931年，至今已有70余年的历史，经过不断的改进和提高已从最初的一种电镜发展为多种电镜，分辨率可达到1Å。近年来，随着电镜计算机的一体化，使新型电镜的操作更为简便，图像获取更快捷，而且电镜图像在观察过程中可以得到即时储存和统计分析等，大大提高了电镜的使用效率。电子显微镜技术是研究细胞超微结构最重要的手段。广泛应用于医学生物学等各个学科，在现代医学科学研究和临床疾病的诊断中发挥着重要的作用。图2-3光学显微镜和电子显微镜结构原理图参照前书图2-3（一）电子显微镜的种类电子显微镜是以电子束作光源、电磁场作透镜、具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜通过收集、整理和分析电子与样品相互作用产生的各种信息而获得物体的形貌和结构等。电镜的类型也是利用电子信号的不同和成像的不同而进行分类。主要分为透射电子显微电镜、扫描电子显微电镜、分析电子显微镜和高压电子显微镜。1、透射电子显微电镜透射电子显微电镜（transmmisionelectronmicroscope），是发展最早、应用最广泛的电镜，一般所说的电镜指的便是透射电镜。透射电镜主要用于观察组织细胞的内部结构。37\n透射电镜由三大系统组成，包括镜体系统、真空系统和电子线路系统。镜体系统是电镜的主体，结构相当复杂，又分为照明系统、成像系统和观察记录系统。照明系统由电子枪和聚光镜组成，电子枪发射电子作为电镜的照明光源。在电镜中电子射线在几万伏的加速电压作用下产生了短波长高能电子束，加速电压越高，电子束的波长越短，电镜的分辨率就越高。聚光镜则将来自电子枪的电子束会聚在样品上并可调节照明强度等。成像系统由样品室、物镜、中间镜和投影镜组成，是电镜具有高放大倍率和高分辨率的关键部位，主要是借助改变各个透镜的电流来获得不同的放大倍率。成像系统的总放大倍率是物镜、中间镜和投影镜放大倍数的乘积。观察记录系统包括观察室和底片室。观察室内有一个荧光屏，电子束穿透样品，带有样品信息的电子经成像系统放大投影到观察室的荧光屏上，激发荧光屏发出可见光，透过的电子多荧光屏亮，反之则暗，荧光屏的亮、暗程度与样品微细结构一一对应，最终产生具有一定反差的影象。图像的保留可通过荧光屏下的底片室内的胶片感光，使图像拍摄下来，也可将图片通过探头输送到计算机中经打印机打出图片。电镜有复杂的真空系统和电路系统以维持镜筒的高真空状态和稳定的工作条件。1、扫描电子显微镜扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope）简称扫描电镜。扫描电镜利用二次电子信号成像，用于观察样品表面形貌，图像具有立体感。扫描电镜的光源部分与透射电镜相同，是由电子枪产生电子射线经聚光镜聚焦形成一束极细的光斑称为电子探针（electronprobe）。电子探针受扫描发生器控制，在样品表面进行逐点扫描，把样品表面的原子外层的电子击出，形成二次电子，二次电子被二次电子检测器收集、转换、放大、转换到显象管，由于显象管的荧光屏上的画面与样品被电子束照射面呈严格同步扫描，逐点逐行一一对应，这样就能看出样品表面形貌。二次电子发射越多的地方，在像上相应的点就越亮，反之则暗。由于二次电子产生的多少与电子束入射角度有关，也就是与样品表面的起伏有关，所以荧光屏上得到的图像反应了样品表面的立体形貌。2、分析电子显微镜分析电子显微镜（analyticelectronmicroscope）简称分析电镜，是一种带有特殊附件波谱仪（lengthdisapersivespectroscope）或能谱仪（energydisapersivespectroscope）的电子显微镜。它可以装配在透射电镜上，也可以装配在扫描电镜上。当高速运动的电子会聚成电子束（探针）打到样品上时，所激发出来的X37\n射线波长是和样品内所含元素的原子序数密切相关的。把特征性X射线根据其波长和强度分别加以收集便可推知样品内包含哪些成分及各元素的含量。利用分析电镜可以在观察样品形貌的同时了解微小区域（如某一细微结构）内所含元素的种类及其含量，在细胞超微结构水平上对其内部的化学元素成分进行定位、定性、定量分析。从而获知结构变化与其组成的元素变化的关系，它的分辨率很高，元素周期表上大部分元素都能分辨出来。1、高压电子显微镜高压电子显微镜（highvoltageelectronmicroscope）指加速电压在120KV以上的透射电子显微镜，若加束电压在500KV以上称为超高压电镜。目前世界上超高压电镜最高的加速电压可达3000KV。高压电子显微镜的主要特点是分辨本领高，对样品的穿透能力强，可用于观察较厚的样品，整体培养的细胞不需超薄切片即可观察内部的三维微细结构，如微丝、微管等，在偏振镜下可呈现三维排列的图象特点。但电镜体积庞大，价格昂贵，难以普及。（二）电镜样品制备技术电镜样品制备技术较复杂，种类也较多，分为普通样品制备技术和特殊样品制备技术。这里简单介绍几种常用的样品制备技术。1、超薄切片技术超薄切片技术（ultramicrotomy）是透射电镜样品制备方法中最基本的一种。由于电子束穿透能力的限制透射电镜观察的样品必须很薄，普通光镜切片厚度约3～5µm，而透射电镜切片厚度则要求在50～80nm左右。这种薄切片称为超薄切片。超薄切片技术包括：取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色。电镜样品采用戊二醛和锇酸双重固定，用酒精或丙酮脱水，环氧树脂进行包埋，超薄切片机切片，采用重金属如铀和铅进行染色以增加细胞结构间的反差。2、负染色技术负染色技术（nagtivestaintechnique）又称阴性染色，是透射电镜样品制备技术中的一种。此技术是指通过重金属盐在样品四周堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小。常用的重金属有磷钨酸钠、醋酸铀等。负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研究工作。负染色样品不需经过固定、脱水包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。3、冷冻蚀刻技术37\n冷冻蚀刻技术（freeze-etchingtechnique）又称冷冻复型，是透射电镜样品制备技术的一种，是将样品经快速冷冻→断裂→升华→喷铂→喷碳而最终形成一层印有生物样品断裂面立体结构的复型膜，然后将生物样品腐蚀掉，用铜网将复型膜捞起进行透射电镜观察。冷冻蚀刻技术能保持细胞原来的结构，立体感鲜明，主要用于生物膜的研究。3、扫描电镜样品制备技术扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括观察面的暴露、固定、脱水、干燥和导电等。样品制备采用戊二醛和锇酸双重固定；乙醇或丙酮脱水。干燥是扫描电镜样品较重要的步骤。由于生物样品柔软多水，大多数的组织含水量在80%以上，采用自然干燥，会受表面张力影响使细胞表面收缩，形态改变。所以多采用液体CO2临界点干燥法，在临界状态时表面张力系数为零，也就是分子的内聚力等于零时干燥，细胞不再收缩，保持了原有的形态。由于干燥样品不导电，因而需要在样品表面镀一层薄薄的金属膜使样品导电并增加图像的反差和立体感。四、扫描探针显微镜技术扫描探针显微镜（scanningprobemicroscope,SPM）是二十世纪八十年代发展起来的一类新型的显微镜，它们都是基于近场扫描原理，利用带有超细针尖的探针在样品表面扫描，获得样品的微观信息如表面形貌、电特性、磁特性和柔韧性等，具有原子尺度的高分辨本领，其侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm。扫描探针显微镜有很多种，主要包括扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope,STM）和原子力显微镜（atomicforcemicroscope,AFM）等。（一）扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜是扫描探针显微镜家族中的第一个成员，是由GBinnig和HRohrer在1981年发明的，他们因此而获得诺贝尔物理学奖。STM的主要原理是利用量子力学中的隧道贯穿效应，其核心部件是一个能在样品表面进行扫描、与样品之间保持一定偏压、其直径为原子尺度的探针（图2-4）。在通常的低电压下，分离的针尖与样品之间（相当于两个电极）具有很大的阻抗，阻止电流通过，称为势叠。当针尖与样品非常靠近时，其间的势叠变得很薄，电子云相互重迭，在针尖与样品之间施加一电压，电子就可以通过隧道效应由针尖转移到样品或从样品转移到针尖，形成隧道电流。通过记录隧道电流的变化就可以获得样品表面的微观信息。STM要求样品表面与针尖具有导电性。37\n图2-4STM工作原理图STM有两种成像模式：恒流模式和恒高模式。在恒流模式中，STM通过反馈系统不断调节针尖与样品表面每个检测点上的距离，使隧道电流保持一个不变的恒值，测定扫描头上针尖与样品表面的高度变化就可获得样品表面形貌等微观信息。在恒高模式中，针尖始终保持在样品上方一个恒定的高度上，隧道电流随着样品表面形貌等微观特性的改变而变化，通过检测每个测量点上的电流变化来获得样品表面微观信息。在恒高模式中，扫描头不需要上下移动，从而加快了扫描速度。（二）原子力显微镜原子力显微镜是1986年设计完成的，它主要通过检测针尖与样品之间的原子间作用力来获得样品表面的微观信息，因此不要求样品具有导电性。AFM的工作原理是将一个对微弱力非常敏感的微悬臂一端固定，另一端装上探针，针尖与样品表面轻轻接触，针尖尖端原子与样品表面原子间极微弱的排斥力使微悬臂向上弯曲（图2-5）。通过检测微悬臂背面反射出的激光光点在光学检测器上的位置变化，可以转换成力的变化，因为反射光点的位置变化或微悬臂弯曲变化与力的变化成正比。微悬臂的弯曲是多种力的共同作用结果，其中最普遍的是范得瓦尔力，针尖与样品表面微小的距离变化就能产生不同大小的范得瓦尔力。通过控制针尖在扫描中这种力的恒定，测量针尖纵向的位移量，就可获得样品表面的微观信息。图2-5AFM工作原理图AFM也有两种工作模式：恒力模式和恒高模式。在恒力模式中，通过精确控制扫描头随样品表面形貌变化在纵向上下移动，微持微悬臂所受作用力的恒定，从扫描头的纵向移动值得出样品表面的形貌像。在恒高模式中，扫描头高度固定不变，从微悬臂在空间的偏转信息中直接获取样品表面信息。SPM具有分辨本领高、可连续动态地在各种环境中（真空、气体和液体）检测物体微观信息等特点，很快被应用于生命科学研究。SPM最早应用于研究生物大分子（DNA和蛋白质等）的结构与功能，这方面已积累了丰富的资料。近年来，在其他方面也展开了积极的才探索，如将AFM用于研究生物大分子之间的相互作用、研究生物结构的纳米操作、研究活细胞的结构与功能以及用于医学和药物学研究等。37\n第二节细胞化学技术细胞化学技术（cytochemistry）是在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应研究细胞内各种成分(主要是生物大分子)的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术，可以通俗地说，这类技术让人们在显微镜下看到细胞内大分子的位置。这类技术包括光镜和电镜水平的酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术和原位杂交技术等。一、酶细胞化学技术酶细胞化学技术（enzymecytochemistry）是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。早期的酶细胞化学工作是在光学显微镜下进行的，称为组织化学（histochemistry），随着电镜技术的发展开始用电镜观察酶的分布，称为电镜酶细胞化学技术（electronmicroscopicenzymecytochemistry）。酶细胞化学技术对研究细胞器的结构与功能、细胞的生理与病理过程以及细胞器的相互关系曾发挥重要作用。近来酶细胞化学技术的单独运用大为减少，但是这一技术的原理导致免疫组织化学或细胞化学技术的诞生和不断更新，而后者则是研究细胞中大分子定性和定位最简便有效的手段，正得到极为广泛的应用。因此有必要了解酶细胞化学技术。（一）酶细胞化学技术的原理显微镜下无法直接观察到细胞内的酶，通过酶细胞化学反应才能间接地反应酶的存在位置。酶细胞化学的原理是：在一定条件下，使组织细胞内的酶与其底物相互作用，形成初级反应产物，再用捕捉剂在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下可见。这一反应过程所示如下：┌────酶细胞化学反应──────┐初级捕捉剂最终酶＋底物────>反应产物─────>反应产物└─酶反应─┘└──捕捉反应───┘从上式可见，酶细胞化学反应实际上由两项反应组成。前面的酶反应相当于细胞内自然条件下发生的酶促反应，后面的捕捉反应则是为了使酶反应可见而人为造成的。37\n捕捉反应的目的是使酶反应产物形成在显微镜下可见的最终反应产物，即最终反应产物在光镜下具有鲜明颜色，在电镜下具有高电子密度。捕捉反应主要有金属盐沉淀法、色素形成和嗜锇物质生成法。如：金属盐沉淀法将重金属作为捕捉剂，使酶反应产物直接或间接与之结合生成金属盐沉淀。在色素形成和嗜锇物质生成法中，捕捉底物在酶作用下转化成色素沉淀于酶作用部位，在光镜下可见；或者捕捉底物转化成嗜锇物质，经锇酸作用后形成高电子密度的锇黑，在电镜下可见。在生物化学中，酶被分成水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶、合成酶和异构酶六大类。现以水解酶为例介绍如下：初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸磷酸水解酶底物→H3PO4最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物磷酸铅（黑色、高电子密度）捕捉剂（Pb2+）H3PO4→Pb(PO4)2（二）实验方法1、样品制备酶细胞化学的一个重要问题是既要保存好细胞内酶的活性，又要保存好细胞的结构，因此选择适当的固定剂种类、浓度、固定的方式和时间是细胞化学技术的一个关键问题。光镜样品固定多选用中性福尔马林或多聚甲醛,4℃、24小时，常规的石蜡包埋切片可以满足相当一部分酶的细胞化学要求；电镜样品固定通常用0.5～2％戊二醛或4％多聚甲醛,4℃、2小时，再切成5～100μm的厚片用于细胞化学反应，反应后经常规的锇酸后固定，脱水、包埋、超薄切片、至电镜下观察。冷冻切片能较大限度地保存酶的活性，因此是光、电镜酶细胞化学技术中常用的方法。2、酶细胞化学反应酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液pH的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。3、基本实验过程37\n光镜样品：固定（酶固定＋结构固定）→冷冻切片→细胞化学反应（酶反应＋捕捉反应）→光镜观察电镜样品：固定（酶固定＋结构固定）→切组织片→细胞化学反应（酶反应＋捕捉反应）→脱水包埋→超薄切片→电镜观察一、免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗原抗体特异结合的特性定位组织和细胞中特异大分子的一类技术。它包括光镜水平（简称免疫组化）和电镜水平(简称免疫电镜)的免疫细胞化学技术。应用免疫细胞化学技术可在原位检测细胞的各种大分子，如蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等。（一）免疫细胞化学技术的原理免疫细胞化学技术的原理是：把组织中的特异分子作为抗原，用各种在显微镜下可见的标记物标记特异抗体或标记抗原抗体复合物，使特异的免疫化学反应具有可见性，从而间接地显示抗原，达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。1．抗原用免疫细胞化学技术检测的分子可以是各种大分子，它们在这一技术中扮演抗原的角色。所以，细胞中的任何分子，只要其结构复杂到一定程度，具有免疫原性，能作为抗原或半抗原，从而能导致针对它的抗体产生，都能作为靶分子，用该技术得到检测。它们可以是蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等，最常见的待检分子是蛋白质、多肽。除了检测组织和细胞中天然存在的蛋白质、多肽，该技术还能检测在培养细胞中人为表达的重组蛋白质分子。方法是利用分子生物学技术制备重组DNA时导入一段序列，该序列编码一个多肽与重组蛋白质连接在一起，该多肽作为抗原或半抗原能导致针对它的抗体产生。当这一重组DNA在培养细胞中表达时，可以因为含有特异抗原或半抗原多肽，而能用免疫细胞化学技术检测到，因而重组蛋白质也就能在同处被检测到。免疫细胞化学技术的这种巧妙应用，近来在研究新克隆得到的蛋白质分子的定位中发挥很大作用，也为该技术开拓了更广阔的应用空间。2．抗体单克隆和多克隆抗体，可从市售获得或自行制备。在免疫细胞化学技术中可以有两个层次的抗体。针对抗原的抗体称为第一抗体，针对第一抗体的抗体称为第二抗体。3．免疫细胞化学中的标记物37\n免疫细胞化学技术是用已知的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法，但抗原抗体相结合的复合物在显微镜下是看不见的，必须用特殊的标记物对抗体或抗原抗体复合物进行标记，才能使抗原抗体复合物在显微镜下具有可见性。常用的标记物有以下几种：⑴荧光素用荧光素标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，在荧光显微镜下检测荧光素所发荧光，便可知抗原的分布部位，常用的荧光素有绿色荧光的异硫氰酸荧光素和红色荧光的罗达明B200等。⑵酶用酶标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，利用酶细胞化学方法显示该标记酶以达到显示抗原的目的。常用的标记酶如辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）与其底物H2O2和氨基联苯胺相遇时，形成的棕色沉淀可在光镜下观察到，遇锇酸反应后形成锇黑电镜下呈高电子密度。⑶胶体金将胶体金与抗体结合形成金标记抗体，再与相应的抗原结合，形成显微镜下可见的电子致密的金颗粒。常用的胶体金颗粒直径为5～60nm。⑷亲和物质亲和物质是一种有多价能力的物质，不仅与另一种亲和物质有高度的亲和力，而且可与抗体蛋白及各种标记物如荧光素、酶、胶体金等结合，因而可以通过荧光显微镜、酶加底物显色反应等定位某种特异分子。常用的亲和物质系统有生物素－亲和素系统、葡萄球菌A蛋白－免疫球蛋白系统。⑸铁蛋白将铁蛋白通过一种低分子的双功能试剂与抗体相结合，它既保留了抗体的免疫活性又具有显微镜下可见的高电子密度核心。2、免疫细胞化学中的直接法和间接法直接法：用标记的特异抗体直接检测相应抗原的方法称为直接法。间接法：用未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中的抗原结合，再用标记的第二抗体与第一抗体结合，间接检测组织中的抗原。这种方法因为在第一抗体上可以结合多个标记的第二抗体，所以其灵敏度比直接法更高（图2－6）图2－6间接法检测抗原示意图参照前书图2-5（二）实验方法37\n免疫细胞化学技术的实验方法包括标记抗体的准备、组织样品的制备及免疫细胞化学反应。1、标记抗体准备抗体标记的基本方法是利用分子间电荷等作用力或使用交联剂，将抗体与标记物连接在一起。但在绝大多数情况下，标记抗体从市场购得。2、样品制备样品固定时既要保存好组织细胞结构和抗原位置又要保存好抗原性。常用的光镜固定剂为多聚甲醛，冷冻切片或常规石蜡包埋、切片；电镜样品多选用多聚甲醛与低浓度戊二醛（0.05～0.5%）混合液，锇酸损伤抗原性，不能在细胞化学反应前使用。电镜免疫细胞化学反应可在未经包埋的组织片上进行，称包埋前技术；也可在超薄切片上进行，称包埋后技术。此外，冷冻超薄切片可直接用于电镜免疫细胞化学反应。3、基本实验过程光镜样品固定（抗原固定＋结构固定）→冷冻切片或石蜡包埋切片→免疫细胞化学反应→光镜观察电镜样品（包埋前技术）固定（抗原固定＋结构固定）→切组织片→免疫细胞化学反应→脱水包埋→超薄切片→电镜观察电镜样品（包埋后技术）固定（抗原固定＋结构固定）→脱水包埋→超薄切片→免疫细胞化学反应→电镜观察三、放射自显影技术放射自显影（radioautography）是利用放射性核素（同位素）的射线作用于感光材料的卤化银晶体，产生潜影，然后通过显影过程把“像”显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。放射自显影技术有光镜和电镜两个层次。光镜放射自显影研究同位素标记物在组织和细胞中的分布；电镜放射自显影研究同位素标记物在细胞超微结构水平上的分布。放射自显影技术通过标记大分子的前体（precursor）来示踪大分子代谢的过程，分析它们不同时期在不同组织、细胞或细胞器中被摄取、转运、贮存及排出的动态变化，从而在不破坏组织和细胞结构的情况下了解细胞、组织和器官的代谢状态，如用放射性DNA前体3H胸腺嘧啶核苷酸标记细胞了解DNA37\n的合成情况等。另外，也可以将放射性核素联结到能与特异大分子结合的探针上，显示特异大分子的定位和定量，如用35S标记的脱氧胞嘧啶核苷参入探针DNA分子，通过原位杂交使这一放射性探针与特异DNA或RNA分子结合，再通过放射自显影显示特异核酸分子在组织或细胞内的分布。(一)放射自显影技术基本原理放射自显影技术基本原理是：将放射性核素标记的物质引入生物体或细胞，参与细胞的正常代谢过程，或联结到能与特异大分子结合的探针上，利用放射性核素放出的射线作用于核子乳胶而显像，从而达到对该放射性物质在组织或细胞内定位的目的，因此，放射性核素对核子乳胶的作用是放射自显影技术的关键。1、核子乳胶核子乳胶是卤化银晶体在明胶中形成的悬浮体，颗粒细小而均匀，具较好的灵敏度，能精确地测定显影颗粒的密度、离子射程和径迹的扩散。2、放射性核素放出的射线放射性核素在进行蜕变时主要放出三种射线，α、β、和γ射线。三种射线都能对感光材料发生作用，但情况各不相同。β射线具有较大的穿透本领和较小的电离作用，在放射自显影技术中有重要意义，在组成生物大分子的主要元素中都有发射β射线的核素如3H、32P、33P和35S等，是放射自显影的重要工具。3、射线对核子乳胶的作用放射自显影的过程和普通的照相过程很相似。射线作用于核子乳胶时，带电粒子和卤化银发生作用，把卤离子的一个轨道电子击出，使其成为卤原子，而被击出的电子为卤离子周围的银离子所俘获，使银离子变成银原子。这就是潜影形成的过程，再经过显影和定影，影像就呈现出来（图2-7）。图2－7核素对核子乳胶的作用参照前书图2-6（二）实验方法放射自显影的主要步骤包括：放射核素的标记、样品制备、核子乳胶膜的制备、自显影和显影及定影等。现以电镜放射自显影为例作简单介绍。37\n1、放射性核素标记所要研究的大分子含有放射性核素、用来示踪大分子的物质叫作示踪化合物。要研究大分子的代谢过程，所选择的示踪化合物必须是所研究大分子的前体。方法是给动物注射示踪化合物，或对培养细胞在培养液中加入示踪化合物。要研究已合成的大分子的定位，则可以通过酶促反应令示踪化合物参入探针，再通过原位杂交反应令放射性探针与所要研究的大分子结合。2、样品制备电镜放射自显影中的样品制备过程与普通样品制备技术相同。3、涂覆核子乳胶膜在带有放射性核素的切片上覆盖一层核子乳胶膜，然后进行自显影过程。制备乳胶膜需在暗室内安全灯光下进行。制备方法包括环套法、浸涂法、平基法等。4、自显影过程（曝光）自显影指在无光条件（暗盒内）下让切片中放射性核素发射出来的带电粒子和乳胶中卤化银晶体作用的过程。自显影过程一般在低温（4℃）和干燥的条件下进行。5、显影和定影经过带电粒子作用而在核子乳胶的卤化银晶体中所产生的潜影，必须经过显影和定影才能把“像”显示出来。显影的作用是使潜影变成不稳定的影像，而定影使已显影的影像稳定下来。6、基本实验过程用于大分子合成过程研究的放射自显影技术：同位素标记示踪化合物→注入动物体内→取下器官或组织→切片→涂乳胶膜→自显影→显影和定影→染色→观察用于大分子定位研究的放射自显影技术：组织固定包埋→切片↓细胞化学反应→涂乳胶膜→自显影→显影和定影→染色→观察↑同位素标记示踪化合物四、原位杂交技术原位杂交技术（insituhybridization）37\n是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。（一）原位杂交技术的原理原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。1、核酸分子杂交DNA双链分子在一定条件下可以发生变性和复性的过程。分子杂交技术利用的就是两条互补的DNA单链能够复性的性质。分子杂交是碱基互补的两条异质核酸单链在一定条件下缔合形成双链分子的过程。这一过程相当于DNA的复性，只是核酸单链的来源不同。原位杂交技术中，以经过标记的已知核酸分子为探针，以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子，造成一定条件使探针与靶核酸分子在原位发生杂交，然后再对其探测(图2-8)。图2-8原位杂交原理图参照前书图2-72、探针标记探针是经过标记的核酸分子，与待测DNA或RNA序列互补。探针主要有cDNA、RNA和寡核苷酸。探针标记物有放射性的和非放射性的两类。常用的放射性标记物主要有35S、32P、33P和3H。非放射性标记物主要有荧光素、生物素、地高辛和溴脱氧尿嘧啶等。通常标记物被导入某个单核苷酸而形成标记分子，如四甲基罗达明-UTP、生物素-UTP、地高辛-dUTP等。然后通过各种酶促反应，如随机引物法或PCR法，使标记分子参入探针。3、杂交37\n不同来源的序列互补的单链核酸分子在一定条件下借氢键相连而形成双链杂交分子的过程为杂交。杂交可发生于RNA与DNA、DNA与DNA、RNA与RNA之间。形成的双链杂交分子为杂交体（hybrids）。4、杂交体的探测对杂交体的探测根据探针标记物的不同而采用各种方法，目的是使标记的杂交体在光镜或电镜下可见。⑴放射自显影如果探针是同位素标记的，显示杂交反应的方法就是光镜或电镜水平的放射自显影技术。方法是在切片上涂覆核子乳胶膜后置于暗盒中于4℃自显影一段时间，然后经显影和定影后观察银离子在细胞和细胞器分布情况。⑵免疫细胞化学对于非同位素标记的探针，可根据免疫细胞化学原理用直接法或间接法将探针标记物显示出来。也就是采用那些在光镜或电镜下具有可见性的免疫细胞化学标记物来直接或间接地显示杂交探针标记物。如用地高辛标记探针杂交后，需加入碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体，再加入酶的底物来显示杂交体。（二）实验方法原位杂交技术的实验方法主要包括：标记探针的准备，组织样品制备，杂交和杂交体探测。1．标记探针的准备对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择，要考虑所要检测的靶核酸分子的性质，如cDNA和RNA适宜于检测mRNA分子，寡核苷酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探针。2．组织样品制备光镜原位杂交标本的固定多使用4%多聚甲醛，常规石蜡包埋和切片，但在操作过程中应提防RNA酶污染。电镜原位杂交标本的固定也采用4%多聚甲醛。与免疫细胞化学技术一样，电镜水平的原位杂交可以在未经包埋的组织切片上进行，称包埋前技术；也可以在超薄切片上进行，称包埋后技术。冷冻切片能较好的保存靶核酸因而较易获得杂交信号，但对细胞结构的保存较差。1．杂交杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记探针与组织中靶分子结合的过程。杂交的效率和特异性是优化杂交条件的出发点，也是需要兼顾的两个方面。影响因素主要是探针的结构、杂交温度、杂交液中的甲酰胺浓度和离子强度、杂交后漂洗等。要通过实验对条件进行优化。2．杂交体探测根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学方法显示杂交结果。5．基本实验过程37\n探针标记→纯化→(变性)↓→涂覆乳胶→放射自显影原位杂交→杂交体探测：→加酶联抗体→加酶底物显色↑→金银染色样品制备→切片→通透处理第三节细胞结构成分的离心分离技术就像可以把细胞从组织中分离出来进行研究一样，人们也可以把细胞器从细胞中分离纯化出来，以研究它们各自特有的的化学组成、酶活性和代谢特点。尽管在一个世纪前就有人试图分离细胞器，但直到20世纪40年代有了超速离心机和细胞匀浆技术后，才真正建立了细胞器的分离技术。用这一技术可以获得相对纯净的各种细胞器和大分子颗粒。使用超速离心机是这一技术的关键，因此该技术称为细胞结构成分的离心分离技术。要进行细胞结构成分的离心分离，需先破碎细胞，通常用渗透压休克、超声振荡或研磨等方法。破碎细胞的悬液称为匀浆，其中包含了核、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物体等多种膜包围的囊泡，还可以有内质网形成的囊泡－微体，它们各有特定的大小和密度，因此可以用高速或超速离心的方法分开。一．离心分离技术的基本原理和方法（一）离心分离的基本原理用超速离心机分离各种细胞结构成分有多种方法，它们都是根据颗粒或分子在离心场中的运动原理来设计的。悬浮液中的颗粒在离心力场中的沉降速度除了与颗粒的质量有关外，还与颗粒的密度、体积以及悬浮介质的密度和粘度有关，悬浮液中颗粒或分子的沉降速度可用stokes公式来表示。dX2r2(ρp—ρΜ)＝×gdt9η式中dX/dt为颗粒沉降速度，X为颗粒到转轴中心的距离，t为时间，r为颗粒直径，ρp为颗粒密度，ρΜ为介质密度，η为介质密度，g为作用于颗粒的离心力。从公式中可以看到，颗粒在离心力场中的沉降速度与颗粒对介质的密度差ρp-ρΜ有重要关系：当ρp>ρΜ时，沉降速度为正数，颗粒向管底沉降；当ρp<ρ37\nΜ时，沉降速度为负数，颗粒向管上方移动；当ρp=ρΜ时，沉降速度为零，颗粒悬浮在介质中不移动。这一基本原理是差速离心和等密度区带离心方法的主要依据。根据Stokes公式，如果在相同的离心力场中，不同颗粒的沉降速度只决定于r、ρp、ρM和η4个因素。在实际应用中,不必分别测定这4个因素的具体数值,而是用沉降系数s(sedimentationcoefficient)来表示颗粒沉降的参数,即2r2(ρp-ρM)s=9η式中s为沉降系数,它与颗粒直径、颗粒密度、介质密度和介质粘度有关,而介质密度和粘度又是恒定的,因此s主要与颗粒的大小与密度有关，是表示颗粒大小和密度的参数。沉降系数的单位以秒（s）表示,一般细胞结构成分的沉降系数介于1～200×10-13s之间，习惯上把10-13s作为沉降系数的单位(Svedbergunit)，简称S。如果一种颗粒的沉降系数是8S，就说明实际的沉降系数是8×10-13s，S值越大，颗粒的沉降速度越大。把s代入Stokes公式，可以简化为dX/dts=g这样，沉降系数就很容易在实验中测定了。（一）离心分离的基本方法细胞结构成分离心分离的方法主要有两类，一类是利用颗粒大小的不同进行离心分离，当颗粒密度大于介质密度(ρp>ρM)时，离心时颗粒向管底移动，移动的速度主要取决于颗粒的大小，大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢，这一类方法包括差速度离心(differentialcentrifugation)和移动区带离心(moving-zonecentrifugation)；另一类是利用颗粒的密度不同进行离心分离，称等密度离心(isodensitycentrifugation)。1、差速离心法差速离心法（diffrentialcentrifugation）通过一系列递增速度的离心，将不同大小颗粒分离。先在低速离心条件下把大的颗粒沉降到管底，其它颗粒留在上清液中；然后以较高的速度离心，把较大的颗粒沉淀于管底。这样依次把不同大小的颗粒逐级分离。这种方法适用大小差别较大颗粒的分离，如各种细胞器的初步离心分离（图2-9）。37\n图2-9差速离心法示意图参照前书图2-42、移动区带离心法移动区带离心法（moving–zonecentrifugation）对于大小差别较小的颗粒,可用移动区带离心法分离。方法是将要分离的样品放在介质溶液表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，在最大的颗粒尚未到达管底时停止离心，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。这种方法必须注意离心时间,离心时间过长，所有颗粒都会沉到管底。经改进，用梯度蔗糖或甘油溶液(从管面到管底密度逐渐增高)作为移动区带离心的介质，可减少颗粒弥散，稳定颗粒的沉降,使形成的区带更明显，便于收集。在移动区带离心法中，介质的密度必须小于颗粒的密度。3、等密度离心法等密度离心法（isodensitycentrifugation）根据Stokes公式，当颗粒密度（ρp）等于介质密度（ρM）时，离心时颗粒悬浮于介质中不移动。等密度离心法就是根据这一原理进行的。采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，把要分离的样品放在密度梯度液表面或者混悬于梯度液中。通过离心，不同密度的颗粒或上浮或下沉，当到达与它们相同密度的介质区带时，颗粒不再移动，结果不同密度的颗粒位于各自的密度区，形成一系列区带。然后停止离心，从管底收集不同密度的颗粒。二、细胞结构成分离心分离的实验方法（一）实验条件的选择（1）离心方法的选择37\n在进行细胞结构成分离心分离时，要根据研究对象选择离心方法。选择的依据主要是颗粒的大小和密度以及各种离心方法的特点。如果样品中颗粒的大小或沉淀系数差别很大，一般采用差速度离心方法就可达到分离的目的；如果颗粒大小差别较小，可用移动区带离心法；如果颗粒的大小差别不大而密度有差别，则应采用等密度离心法；如果两种颗粒的大小和密度都相似，就必须通过适当方法改变某种组分的性质，然后进行离心分离。另外，不同方法的特点也是考虑的因素，如差速离心法离心时间比等密度离心法短，而且所用介质浓度也比较低，对细胞结构成分的损伤和抽提都比较小，因此适用于细胞结构成分的分析分离；而等密度离心法在一定体积的介质中可以分离较多的细胞成分，适用于细胞结构成分的制备分离。（2）介质材料的选择理想的介质材料应该是：形成的溶液密度范围大、粘度低，对细胞结构成分损伤小，离心分离后容易去除，浓度容易测定等。常用的介质有蔗糖、甘油等亲水有机分子和氯化铯、硫酸铯等重金属盐。蔗糖和甘油溶液的最大密度是1.3×103kg/m3,能用来分离较低密度的膜性细胞器如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体等。重金属盐溶液的最大密度可达1.9×103kg/m3，可用来分离密度大于1.3×103kg/m3的分子，如DNA、RNA、核糖体等。由于重金属溶液密度很大，在离心力场中会自动形成密度梯度，用来分离的物质可直接与重金属盐溶液混合，然后进行等密度离心。（二）细胞器的分离（1）细胞器的释放在分离细胞器之前必须破碎细胞、释放细胞器。破碎细胞的方法有低渗处理、超声振荡、冻融、用匀浆器打碎等多种细胞匀浆，但最常用的方法还是细胞匀浆，即采用机械方法破碎细胞使其匀浆化，滤去细胞碎片后制成细胞器悬液。（2）细胞器的初步分离用差速离心法分离各种细胞器。先用500～1000×g离心，使大的细胞组分沉降，沉淀中主要是细胞核，还包含一些细胞碎片；将第一次离心的上清液用10000～20000×g离心，使中等大小的细胞器沉降，沉淀中包含线粒体、溶酶体和过氧化物酶体；将第二次离心的上清液再用更高的速度（～100000×g）离心，使小的细胞器如微粒体、内质网、高尔基体和质膜沉淀，上清液中剩下胞质溶胶的有关成分。细胞器在每一步离心沉淀中的分布可随离心速度和时间的不同而有一定差别。一般说来，用差速离心分离的细胞器不是很纯的，要获得比较纯的细胞器必须把初步分离的细胞器进一步纯化。（3）细胞器的纯化可采用不同的方法进一步将初步分离的细胞器纯化。如线粒体、溶酶体和过氧化物酶体虽然大小相近，但密度不同，可用等密度离心进一步分离；细胞核部分则可用高密度蔗糖溶液（2.0mol/L）的差速离心法来纯化。对分离细胞器纯度的鉴别主要有两种方法：一种是电镜作形态鉴别；另一种方法是生化分析，因为已知每种细胞器都含有某些特殊的分子，可作为标志用于鉴定细胞器（表2-1）。细胞器标志分子(标志酶)细胞核NAD合成酶、DNA聚合酶37\n线粒体细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶溶酶体酸性磷酸酶、酸性脱氧核糖核酸酶过氧化物酶体过氧化氢酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶内质网葡萄糖-6-磷酸酶、酯酶、细胞色素P450高尔基体核苷二磷酸酶、β-半乳糖苷转移酶质膜5’-核苷酸酶、碱性磷酸二酯酶胞质溶胶糖酵解的酶类、磷酸葡萄糖变位酶细胞器分离纯化后，一方面可对细胞器的化学组成、酶活性和代谢特点进行分析，另一方面可将分离的细胞器在体外进行该细胞器的功能实验，称为无细胞系统(cellfreesystem)实验。目前有关细胞器结构与功能以及细胞中的重要反应过程的资料，如蛋白质合成机制、蛋白质分选和运输等，有不少来自分离细胞器的生化分析和无细胞系统实验。第四节分析细胞学技术分析细胞学是从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成及含量以及细胞的各种功能等进行研究，将以往各种细胞学技术从定性、定位进一步发展到定量的研究，获得定量的测量数据，以更客观地揭示生命活动的规律。分析细胞学技术的发展有两个主要领域，固定式细胞分析和流动式细胞分析。固定式细胞分析是指细胞样品固定在载玻片或培养皿上，通过显微镜，由成像系统获取图像，定量分析细胞的形态学参数和细胞内一些生化成分的含量。常用仪器有显微分光光度计、图像分析系统和激光扫描共聚焦显微镜。流动式细胞分析要求将细胞样品悬浮在液体中，这些细胞悬液加入仪器后，高速度地流过仪器的检测区，仪器检测悬液中每一个细胞，并进行分析测定，记录每一个细胞众多的生物学参数，并可根据预选的条件将其中特殊的细胞亚群分选纯化出来，以供进一步的深入研究，这类仪器统称为流式细胞仪。以下对流式细胞分析技术、显微分光光度计和图像分析系统作简要介绍。激光扫描共聚焦显微镜已在显微镜技术一节介绍。一、流式细胞分析技术流式细胞仪（flowcytometer，FCM）37\n从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪，它是结合激光技术、光电测量技术、数字计算机技术和荧光细胞化学技术的产物，是分析细胞学领域的重要仪器。流式细胞术是一种对悬液中单个细胞或细胞器进行高速测量和自动分析的测量技术，每秒能测量数万个细胞并多参数检测，还能在分析的同时分选出有指定特征的细胞。（一）流式细胞仪的结构与原理流式细胞仪的一般结构可分为三个部分，细胞流动室和液流驱动系统；激发光源及其光束成形系统；细胞信号检测和分析系统（图2－10）。这三部分在仪器中一般按三个互为垂直的轴线安置，即X轴方向的激发光轴线、Y轴方向的细胞荧光信号检测轴线和Z轴方向的细胞流轴线。此三个轴线的交点即为仪器的细胞信号检测区。样品中的每一个细胞必须按顺序依次以相同的速度和轨迹通过此检测区。每一细胞沿Z轴流经检测区时，受到激发光照射。细胞受光照时产生细胞的散射光信号与荧光信号，这些细胞信号由检测器收集，经计算机软件分析处理，这就是流式细胞分析。流动室是流式细胞仪的核心部件，它采用液体动力学分层鞘流技术，层流技术保证样品中的每一细胞都沿流动室的中心轴运动，实现了每一细胞以相同的速度、相同方向、相同的轨迹逐个依次通过检测区，流动室也可称为单细胞流发生器。激光是一种单色性、方向性、相干性好的高强度光源，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。流式细胞仪的激发光源通常采用有多条可调谐的输出谱线的氩离子气体激光器，它能与多种荧光染料激发谱匹配。在实际应用时，一般采用单谱线488波长作为激发光源。检测器采用多通道光电倍增管，由数字显示器和示波器实时显示各种信号波形及数据参数，结果由计算机分析处理。图2-10FCM工作原理图参照前书图2-8流式细胞仪分选装置一般由超声振动器、液滴充电电路、静电高压偏转场等组成。细胞分选是在细胞分析的基础上进行的，经确认需要分选的细胞，在该细胞到达液流断离端的即刻，由液滴充电电路发出一个充电脉冲，保证该包含有要分选细胞的液滴断离后带有静电荷。带电液滴向下运动经过高压偏转电场时，在静电力的作用下偏离原运动轨迹。带正电荷的液滴偏向负极，带负电荷的液滴偏向正极。静电高压值一般是固定的，调节充电脉冲幅度，改变液滴荷电多少，可改变充电液滴的偏转角和偏转距离。分选所得的细胞可以用玻片、试管、96孔板等进行收集,37\n结合分选后的细胞培养、细胞形态学观察、细胞图像分析等结果，可以综合单个细胞的更多信息，这是其他细胞学技术难以实现的。流式细胞仪中被测样品的细胞，流经仪器检测区时受到激发光的照射，激发光与细胞相互作用后可产生散射光信号和荧光信号。散射光信号是指激发光与细胞相遇作用后反射、折射、衍射等综合的结果，它能反映细胞群体及其不同亚群形态学的一些信息，并且不依赖细胞样品的荧光染色过程。荧光信号主要是指经过特异荧光染色后细胞受照发射的荧光信号。各种特异荧光染色方法是针对细胞内各种不同的生化成分或各种特异抗原等设计的。每一种荧光染色方法中必须用到一种或多种的荧光染料。由于每一种荧光分子结构不同，考虑荧光激发谱与荧光发射谱的接受时，通常要注意选择合适的激发光源和各类分束滤色片。流式细胞术为了保证获得准确的测试分析结果必须进行必要的质量控制，选用标准荧光微球和固定的鸡血细胞是最常用的仪器参考标准。（二）流式细胞术样品制备流式细胞术要做高精度的单细胞定量分析，对细胞样品的制备技术有着特殊的要求。一般包括单细胞悬液的制备和细胞荧光染色。1．单细胞悬液的制备流式细胞术的分析检测建立在单个细胞的基础上，制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环。对不同来源和不同形式的样品，根据各种样品的特点可选择不同的分散方法。（1）单层培养细胞、血液、各种脱落细胞等样品，标本经过简单的制备悬液，离心分离处理，就可以得到分散较好的单个细胞悬液，是理想的流式细胞术检测对象。（2）对于不同组织来源的实体组织标本，采用酶消化法、机械法和化学试剂处理法来分散细胞。（3）石腊包埋组织单细胞悬液的制备，可使大量存档的临床资料重新得到研究与利用，从而扩大了流式细胞术的应用范围。样品制备一般通过切片、脱脂、水化、消化及终止消化后过滤再收集细胞悬液，去除碎片的单细胞悬液用70%酒精固定保存。流式细胞术所测的细胞样品要求细胞呈单个分散状态，其中细胞团块，细胞碎片尽可能少，分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证下一步的荧光染色处理。所以在实际应用时，一个理想的单个细胞分散的细胞悬液样品的制备往往是两种或多种方法的结合使用，才能获得理想的细胞悬液。2.细胞的荧光染色流式细胞术快速分析单细胞的各种生物学特性和各种生化成份并定量测定这些参数是通过荧光细胞化学方法实现的。与光镜下或电镜下的细胞化学方法一样，对细胞内的每一种生化成份都可以找到其特异的荧光细胞化学染色方法。由于流式细胞术所需求的荧光细胞化学过程必须在细胞悬液中进行，因而又有其特点。细胞荧光染色必须选择适当的荧光探针。荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即所用荧光染料与所感兴趣的细胞成份是否为特异性结合，严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。染料的荧光光谱和量子产率是受环境因素影响的，在相同的条件下，荧光反应产物的产率（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系，因此足够的特异性和可靠的定量关系是荧光细胞化学过程的两个基本评价标准。37\n现在荧光探针已有几千种，正确选择荧光探针是首要工作。常用荧光探针有细胞活性探针，有活细胞荧光探针和死细胞探针之分；膜荧光探针主要用于生物膜以及脂质转运和代谢动力学研究，较多地用于膜融合和脂质转移的观察；离子膜探针有阴离子型膜探针，大多数探针荧光基团标记在脂肪酸的烷基上，阳离子型膜探针较易定位在胞膜，可检测膜表面积和细胞体积的改变，中性膜探针包括非极性和两性探针，有可能对膜有特异的亲和力；细胞器探针能够渗透到细胞内，选择性地与细胞中的细胞器结合的荧光物质，实质上就是荧光染料；位点特异性探针是指可选择性地与生物大分子相结合或进入细胞内与某些特异位点相结合，来研究细胞内外结构及其活性的探针；胞内离子探针利用荧光检测细胞内各类离子浓度，包括Ca2+、Mg2+、Na+、和H+等，其它还有可溶性荧光探针、核酸荧光探针、电位敏感性荧光探针、底物荧光探针和笼锁化合物荧光探针等。目前，流式细胞术广泛应用于细胞含量测定、核型分析、细胞凋亡检测、细胞免疫表型分析、细胞因子检测和细胞分选等方面，应用范围在不断地扩大。二、显微分光光度术显微分光光度术（microspectrophotometry，MSP）实质上是显微镜技术和分光光度技术的结合。它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测量基础，可以对细胞内的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试，是组织化学和细胞生物学中定量研究的必不可少的工具。显微分光光度计由主控计算机、多功能显微镜、透射和落射光源、单色仪、高精度扫描台和光电倍增管等构成。常用测量方法有显微荧光光度术（Microfluorometry）、显微密度术（Microdensitometry）、细胞光度术（Cytophotometry）显微反射光度测量及波长扫描测量等。与通常的生化定量方法相比，用显微光度术测定物质含量的主要优点是所用材料少，在同一涂片上测得多个参数；结合形态学特点，可选择测定单个细胞或细胞器内的多种物质及细胞的代谢产物，同时可将测量光栏定位于细胞的某一部位或细胞器中；整个测量不需复杂的纯化过程，能在短时内测得结果，便于观察药物作用对细胞活性改变的影响（一）显微吸收光度术测量显微吸收光度法时一种光度测量的化学方法，它基于细胞内的蛋白质、多糖、核酸、脂类和酶染颗粒能在不同等电点下电离出不同侧基，因而造成对染料亲和力不同，应用不同的化学试剂染色，可使不同的细胞组分染上不同的颜色，在显微镜下成为可见的结构。染料于组分的结合必须是特异性的，即染料、细胞组分结合物的光吸收是遵循朗伯-比尔定律，而且染色深浅与被染细胞组分之间呈化学剂量学关系，符合这两者关系的样本就可应用吸收测量法，通过光检测器（可使光能变成电能）测量有色化合物吸收单色光的量。当光束通过固体液体或气体介质时，常有部分光被吸收转换成其他形式的能量。物质的光吸收和光波长有关，其吸收能力可通过测定入射光经测量区域的前后光强度换算出光密度来定量分析，它的吸收特性必须遵循朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。朗伯-比尔定律规定，当单色的平行光通过均匀溶液时，溶液的吸收能力和溶液的路程长度及溶质浓度成正比。可通过消光度A来确定。A=-lgT=lgIo/I=K·C·L37\n式中T为溶液透光率，Io和I分别为入射光强和透射光强，K为吸收常数，C为吸光溶质浓度，L为光程。由于光强度比较容易测量，经单色仪或干涉滤光片能得到单色光，显微镜近轴区的照射光近似于平行光，所以凡在涂片切片中含有吸光特性的物质,理论上均可采用吸收光度法测量。动植物中许多天然有色物质如肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素c等，可用吸收光度法测含量；组织化学法染色的完整细胞的涂片如DNA的福尔根染色，可用该方法测量胞核DNA相对含量；还可用该法进行各类酶标的定量测量，对蛋白质进行干扰校正后在天然吸收基础上测定核酸含量。显微吸收光度测量需满足朗伯-比尔定律条件，待测物质需为均质，但生物学物质很少是均质的，而且显微镜成像过程中，经过光路系统各界面多次折射反射后会导致测量中的分布误差、闪烁误差、系统误差等，影响测量精度。所以除校正系统至最佳状态外，常用双波长法、一波二区法和扫描法来消除误差。扫描法是最令人满意的方法。测量时，先将待测物分成大量小区域，近似认为每个小区域内物质分布为均质，采用顺序逐点扫描法测出各小区域的消光度，经积分后换算出待测物的总消光度，求得其相对含量。扫描法根据不同扫描方式可分为：飞点扫描、像扫描、物扫描、TV扫描等。在实际测量时，台物扫描是最常用的方法，在高精度扫描台上放好样品，确定其扫描范围和波长，根据放大倍数确定测量光栏的大小，根据待测物确定单色入射光波长，选取全自动扫描后由计算机数据处理并显示结果及扫描图形。台物在x方向和y方向上来回移动，而测量光栏位置不动，使台上的被测物质各小区域依序进入测量光栏内而被测量；也可用影象扫描，台物不动，测量光栏的象在台物上沿x方向和y方向来回移动，扫描测量重复性好，准确性和灵敏度高，测量精度可达10-9g，可方便地进行细胞内细微结构的分析，区分不同细胞类型的差别。（二）显微荧光光度测量定量显微荧光光度测量是组织化学和细胞化学中的另一种重要技术，可通过测试固定组织细胞内的荧光反应物来对生物学标本进行定量分析。荧光种类有物质的自发荧光或是用荧光染料对某些生物学物质作特选染色后产生的继光荧光。与吸收光度测量相比，显微荧光光度测量有许多明显的优点。一般荧光测量所用染料浓度远比吸收法低，甚至可低10000倍，尤其在背景足够暗时可对低浓度荧光物质高度敏感，可测量细胞内分散的微小颗粒。荧光物质本身是自发光体，无论测量孔径内物体形状规则与否，物质分布均匀与否，物体辐射的光量子在光电倍增管上都产生同样的效应，所以无需扫描测量就可避免分布误差。通过选取适当的激发波长和发射波长的谱线和宽度，可以做到高特异性的测量，通常显微分光光度计选用适当的窄带滤色片来获取所需荧光波长，高精度的显微分光光度计采用光栅单色仪，可获得5nm带宽的激发波长和检测波长。荧光光度荧光测量方法分有堵塞法和扫描光度法，测量多数采用堵塞法，选取足够大的测量光栏对待测物作总体荧光量测定，样品由计算机定位，可快速测量，适于大样本分析。荧光光度测量缺点是：荧光易衰减，有漂白作用，有时会猝灭，还必须减去本底荧光值。因此测量时要提高信噪比，必须掌握适当的激发时间和合适的荧光标准。三、图像分析系统37\n图像分析（imageanalysis，IA）是分析细胞学中主要测量手段之一，常用于细胞形态分析、肿瘤细胞分析、染色体核型分析等方面，借助于显微分光光度技术，还可定量测试细胞内DNA，RNA含量和分布，随着图像分析处理技术的进展，图像分析处理的方法也由静态到动态，由平面到三维立体，由单色到真彩色而不断进展，它在生物医学应用领域中的作用将越来越重要。图像分析处理通常是指计算机数字图像处理(imageprocessing，IP)，为了便于用计算机处理，必须把图像作为二进制数值来表示。普通光学系统和电视摄像等成像设备得到的是模拟图像，图像在二维平面上位置和强度的分布是连续的，要得到数字图像，必须对模拟图像进行空间点阵上的抽样和颜色灰度的量化的数字化操作，得到以像素为基本单位的数字矩阵，每个像素的颜色由灰度值表示，通常量化成8比特(bit)，即256个灰度等级。所谓数字图像就是灰度值的二维数组图像，如用函数F(x，y)表示数字图象，F(i，j)除了代表图像中位于i，j处的像素的同时，还表示该像素的灰度值的大小。数字图像一般采用正多边形点阵，最常用的是正方形点阵，如图2-11所示。图像数字化的精度对图像质量会有很大的影响，像素越多，图像分辨率越高，灰度等级越高，图像层次越丰富，清晰度高。数字图像运算建立在数字矩阵基础上，有许多基本处理功能和算法形式，与模拟图像比较具有精度高，通用性强，再现性和灵活性好等优点。图2－11数字图像示意图参照前书图2-9图像分析系统一般由计算机，图像输入设备，图像输出设备和交互控制设备构成。计算机系统，要求运算速度快，内存大，图像阵列处理器和显示卡的内存也应尽可能大，配备大容量存贮器便于图像备份。图像输入设备常用的有高解像度的摄像机、CCD摄像机、扫描仪和数码像机等。图像输出设备有视频打印机，激光打印机，图像硬拷贝机等。交互控制设备有鼠标和数字化图形输入板，可以用人机对话的方式选取工作菜单，执行指令，还可控制图形的输入和处理。图像分析系统的核心部分是图像分析处理软件，分为通用软件和专用软件，它直接决定了分析结果的优劣。医学图像成像方式多种多样，来自不同途径的图像不可避免地存在着噪声和畸变，为了得到较好的图像分析处理结果，37\n提取我们感兴趣的图像细节，首先必须进行图像增强(imageenhancement)，在成像过程中原图中总存在各种噪声和畸变，为使像质得到改善以利于特征提取和图像识别，对图像进行预处理，目的是图像增强也叫图像质量改善。图像增强的方法很多，对比度增强可通过灰度变换，直方图均衡等方式提高图像的对比度和清晰度。阴影校正和图像多帧数学运算可消除成像系统形成的照明场误差，改善图像的阴影，畸变和明暗差，突出感兴趣的图像特征。锐化处理通过微分法或梯度法等高频滤波算法可消除图像的模糊，增强图像高频成分，使图像轮廓分明。平滑处理常用局部平均法，中值滤波法有效地去除图像中高频噪声。为了根据图像的结构特征，分离出感兴趣的对象物，以便进行图像识别和分析，图像分割(imagesegmentation)是选取灰度阈值，区分主要对象、其他对象和背景的主要手段。图像分割通常用二值化阈值处理，根据图像的灰度直方图确定对象物的阈值，使对像物和背景以0和1分别显示，便于计算机处理，也可进行多相分割，通过灰度直方图中多个峰值加以区分，分别定出阈值，根据灰度阈值范围分割出各类对象物。图像二值化处理(imagebinary)通过各种矩阵算子对二值图进行腐蚀膨胀，开放封闭，填空洞，擦碎片，骨骼细化等形态学方法处理，也可采用布尔代数方法，进行逻辑运算，从而整理图像画面，清除不感兴趣的对象，便于计算机最终进行模式识别和特征提取，这种图像整理方法是图像处理不可缺少的步骤。经图像分割和二值化处理后的图像，突出了对象物形态特征，最后进行图像识别(imagerecognition)和图像分析，通过对图形特征的编码识别和描述，进行特征提取，然后进行全自动和交互测量分析。图像分析还可以作图像重建(imagereconstraction)和图像复原(imagerestoration)。人眼只能感觉可见光，对可视图像进行判读和分析，对那些通过各种传感器观测的不可视信息的图像数字化是图像重建的一个重要内容，另外利用傅立叶变换等方法对X线断层扫描图像进行三维重建复原出体内器官的三维立体图形等，也是图像重建的重要内容。图像复原是利用各类滤波方式消除图像中噪声和模糊，改善图像质量。第五节细胞培养生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（invivo）的功能活动是非常困难的。在实际工作中，人们常常从生物体内取出组织或细胞，在体外(in37\nvitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们的观察研究，这种方法就是细胞培养（cellculture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissueculture），二者可作为同义语使用。细胞培养的工作始于20世纪初（Harrison，1907），目前已广泛应用于生物学、医学的各个领域。细胞培养主要具有两个方面的优点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，因此可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。一．细胞培养的基本知识（一）培养细胞的类型及其特点体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。1．贴附型大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。2．悬浮型少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。（二）培养细胞的增殖过程1．培养细胞一代的增殖过程培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间相对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（passage或subculture37\n）。从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是细胞培养一代与细胞倍增（doubling）的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在0.5-4h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24h。随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称对数期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适于进行实验研究；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长期。2．培养细胞的生命期（lifespan）培养细胞的生命期指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。原代细胞一经传代后便称为细胞系（cellline），进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。3．培养细胞的生存条件培养细胞需要特定的培养基和培养设备。（1）培养基培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培养基中。培养基的种类很多，按其物质状态，分半固体培养基（如软琼脂培养基）和液体培养基两类，其中液体培养基（即培养液）使用最为广泛。用各种合成培养基配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。一般情况下需添加10～20％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，加2～5％血清含量即可，称为维持培养液。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素100μg/ml）。（2）细胞培养设备37\n培养细胞在培养器皿中生长，浸浴于培养液，并需要特有的环境，包括一定的温度、湿度和气体成分。培养器皿主要有碟和瓶两类，材质为玻璃或塑料，现在使用一次性的塑料培养器皿日益普及。培养环境通常由CO2恒温孵育箱提供，恒定地提供37°C温度、95％湿度和一定量的CO2（通常为5%），CO2可使培养液维持稳定的pH。另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作时需在无菌工作台上进行。二．细胞培养的基本技术（一）细胞分离和原代培养原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用低速离心法分离。培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用胰蛋白酶或胶原酶消化法使组织进一步分散，以获得细胞悬液。（二）培养细胞的传代细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离培养称之为传一代。培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁细胞的消化传代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）的消化液消化传代。EDTA能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。消化液使细胞脱落形成细胞悬液，然后以合适比例接种在新的培养瓶内。悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，以一定比例稀释传代。（三）细胞的冻存和复苏培养细胞在传代中性质易发生改变,有支原体污染的危险。研究工作也要求细胞株的代数应维持在一定期限内。解决这些困难的方法就是将细胞冻存，需要的时候再行复苏。冻存前需向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），以减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。细胞冻存在液氮中，从理论上讲贮存时间是无限的。（四）细胞培养微生物污染的检测细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染，主要污染微生物为霉菌、细菌和支原体。可用多种手段明确污染性质，从而从源头上杜绝污染。然而微生物污染一旦发生，多数无法救治。为了防止污染的蔓延，应及时丢弃污染细胞。37\n第六节细胞工程技术广义的细胞工程（cellengineering）指所有应用于生物学和医学的、以细胞为操作对象的技术手段，其中也包括细胞培养。一般地说，细胞工程主要指应用各种手段对细胞不同结构层次(整体、细胞器、核、基因等)进行改造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，以获得具有特定生物学特性的细胞。一．细胞融合技术在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（cellfusion）。通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。细胞在生长过程中，可能发生自发的融合，但几率很低。在实际工作中常采用各种促融合手段，包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电激融合法等。在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。图2－12细胞融合技术制备单克隆抗体参照前书图2-101975年Koehler和Milstein将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。对这种融合细胞进行克隆化以后，即可获得来自同一细胞克隆的抗体，这种抗体具有高度的均一性，称为单克隆抗体(图2－12)。二．核移植技术37\n细胞核移植（nucleartransfer）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受体子宫里。实际上，胚胎细胞核移植技术的应用已有半个世纪的历史，德国科学家Spemann于1938年最先提出并进行了两栖类动物细胞核移植试验。中国学者童第周于1963年在世界上首次报道了将金鱼等鱼的囊胚细胞核移入去核未受精卵内，获得了正常的胚胎和幼鱼。体细胞核移植也在上世纪六十年代在非洲爪蟾获得成功。1997年英国罗斯林研究所Wilmut首次报道以高度分化的成年母羊乳腺细胞为核供体克隆出小羊“多利”。“多利”的诞生在理论上具有重要意义，说明高等动物高度分化的成体动物细胞核仍具有发育的全能性。目前，通过体细胞核移植获得的“克隆鼠”、“克隆牛”等均已面世。三．基因转移技术基因转移（genetransfer）指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下，能稳定接纳外源基因的细胞只有受体细胞总数的千分之几。因此为了快速有效地筛选转化细胞，一般在转入基因中携带有特定的选择标记，目前应用较多的为细胞抗药性筛选，如根据新霉素抗性基因进行筛选。基因转移又常称为基因转染（genetransfection）。1．物理学方法包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射。电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米大小的微孔，使外源DNA转移到细胞中。该方法较为简单，广泛应用于培养细胞的基因转移。显微注射法主要用于制备转基因动物。该法的基本操作程序是：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后从雌鼠输卵管内取出受精卵；借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄性原核内；将注射了基因的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，繁殖产生转基因小鼠。该方法转入的基因随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变。37\n裸露DNA直接注射法是最简单的基因转移方法。将裸露DNA直接注射到组织后，DNA有可能直接被细胞所摄入。外源基因进入细胞的效率与局部组织或细胞的损伤程度有关，基因在体内的表达时间与机体的免疫功能有关。2．化学方法基因转移的化学方法包括DEAE－葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体法等，是通过增加细胞膜的通透性、增加胞吞或胞饮、增加DNA与细胞的吸附等机理而实现基因转移的。这些方法多用于培养细胞的基因转移。DEAE－葡聚糖法将外源DNA片段与DEAE－葡聚糖等高分子碳水化合物混合，形成的含DNA的大颗粒黏附于受体细胞表面，通过其胞饮作用进入细胞内。这种方法的转染效率较低。磷酸钙共沉淀法是使待转化的DNA与磷酸钙共沉淀形成大颗粒，颗粒悬液与细胞一起孵育，颗粒通过胞饮作用进入细胞。该方法转染效率至少是DEAE－葡聚糖法的100倍。脂质体（lipofectin）法令脂质体试剂与DNA作用将DNA分子包入其囊状结构中，携带了DNA的脂质体可与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质和细胞核内。该方法基因转移效率很高。3．生物学方法基因转移的生物学方法主要指病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛痘病毒载体）、反转录病毒载体等。用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒，感染细胞后仅能将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。这种方法的缺点是：所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应；都或多或少地存在一定的安全隐患；而且转导能力有限、不适于大规模生产。（易静、朱平、胡庆沈、高飞）参考文献1AlbertsB.Brey,D.,LewisJ.etal.MolecularBiologyoftheCell.4thed.NewYork:GarlandScience,2002.2Lodish,H.,Berk,A.,ZipurskySL.etal.MolecularCellBiology.4thed.NewYork:WHFreeman&Co.,2000.3CooperGM.TheCell-AMolecularApproach.2nded.WashingtonD.C.,Sunderland,Massachusetts:SinauerAssociatesInc.,20004KarpG.CellandMolecularBiology:ConceptsandExperiments.3rded.NewYork:JohnWiley&SonsInc.,20025陈诗书、汤雪明.医学细胞与分子生物学.上海:上海医科大学出版社,1995.6左连富.流式细胞术与生物医学.沈阳:辽宁科学技术出版社,1996.7李楠、尹岭、苏振伦.激光扫描共聚焦显微术.北京:人民军医出版社,1997.37\n腺妆趟夜抢止亭渐恳络帧萧益栋溯绕却体哟苞诱啡丘凤斜莱瞻雨些箭烩迄驼视稼恫男移衙唬趴窖蛊率靳躁婴食椎摔愤拇岸耸纪炙屑龙睛汤吹改膛煌堰镭烁洋鞋宁挞雕咨众卿养牧正庐嫩盏容猜握抡刀其醛沉扛类蝇严沉捡擂润蚕牢雄饲钉瀑侩田荧胃腹酵兄蝗冠迪冗尸速砰掐棚贫椿韧志悦孰儿史胶对鸳奏蒂督讫说托宰隆祥暑欠最宙跃良妖瘴蛊担嫁枉怂厕癌侠缕莹苗坦扇扛婆跨粕渐议窿赤圃锌田农焉绸滋唆况幌窘步池捂免拄绊钒两嗽掏弃输琉军居套几眯宫畴痊贸也灰俩稿昔瞳拭鄂啃角度鸣所仓馒疑盟曳祁呕烬猩拿因直廓笑鄙寺严拜吼敖沙镊驹芝巢颧量吵燃拈扇辽瞥抓横帖赖瓦茎序佃嘴细胞生物学技术雄昭李饼礁蚀围警器掀螺蚀巧颜罗审磷腮和缮舒莎乓咏肃淮重堪咒拯姿泥入尾寥萤郝湾跋圣庞译旧择杆滓培涟耕喷毋押洗遮演短濒撂儒急遇座量瀑宰磨睁伙速隘慕罢灰妮过葡赡荫恬烟衫斯但沫荣微瘫首由迢绪均阿乐鄙达斡陌如辣澳避赣翁碳只调输足宫跳潮鸣共市织坝邮渝臀郭益蔑损屿夫慕篓或岛蛔谐届嘿暗迅拌娱猜宿蛊捡吉摄岔叮翘忿滇类屁羞柱宴玲镑段棒机叶墩糯察收频赡眨嘲擒幽乎慌戏要两坎胁摹期劝换反避篆狂驾参止寒理赵锤阉畦莫塞颁除台桨恒套租悼父颓胳稿而矩捕苫沽壤魁懦懈品延邯礁殴敬蔚拿嘘替常呈睫措辗逃躯过盂嘶侯四预瞧眩堕莽队镀焚籽冀骑入紫鲁瓷煤解内存大,图像阵列处理器和显示卡的内存也应尽可能大,配备大容量存贮器便于图像备份.图像输入设备常用的有高解像度的摄像机,CCD摄像机...慕蹭嘱铲币锈行哩讳呐穴岭谰汽师求柑音殴乔冠熄谆他危佃矽沂踊驾惊积狰妹捎扭氮兜涣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