分子生物学与细胞生物学实验基本技术

分子生物学与细胞生物学实验基本技术

分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02\n实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒置相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1NHCl\n1.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。5.贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。6.培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。7.换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。注意事项1.取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。3.组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。4.原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。审实验二消化培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养二、概述此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例）三、材料：（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱\n1.摇床（37℃）2.冰箱（4℃、-20℃）3.倒置相差显微镜4.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头、直头）3.烧杯（200ml、10ml）4.玻璃瓶（250ml、100ml）5.玻璃漏斗6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.15ml离心管5.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩）5.红血球计数板6.泡沫板7.大头针8.尼龙网膜（140目）（五）试剂1.D-Hanks液利益2.小牛血清3.DMEM4.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）6.1NHCl7.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：取新生1～3天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒3次，用大头针将乳鼠固定在泡沫板上，无菌操作下打开胸腔，取出心脏，放入装有D—Hanks液的培养皿中。2.组织修剪、漂洗：修剪去除血管等杂组织，D—Hanks液中漂洗数次，以除去血块等。3.剪切：将心室肌用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成1～2mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。4.消化：将组织小块转移至100ml的玻璃瓶中，再加入30～50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，37℃摇床消化6min左右。5.\n细胞分离：消化完毕，用吸管轻轻吸吹几下，使组织小块散开，静置2min后，吸取上面的混悬液（弃去第1次的混悬液），经140目尼龙网膜过滤至盛有终止液试管中，1000rpm，离心10分钟，弃去上清，加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加入30～50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，重复第4、5步骤，直至大部分组织小块消失。1.细胞计数：将上述获得的细胞悬液，吸出少许，适当稀释，加台盼蓝溶液染色，用红血球计数板计数活细胞和死细胞，计算细胞密度和存活率。2.细胞接种：将细胞接种至30ml的培养瓶中，每瓶6×105，用含15%小牛血清的DMEM培养液培养。3.培养：5%CO2、37℃培养箱培养12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细胞开始搏动。4.换液：培养3～5d，细胞换液。五、注意事项1.取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。2.从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500~1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。3.原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。审实验三细胞传代一、目的学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。二、概述培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃）5.倒置相差显微镜6.培养箱（二）玻璃器皿1.吸管（弯头、直头）2.玻璃瓶（250ml、100ml）3.培养瓶4.废液缸（三）塑料器皿1.吸头\n1.枪头2.胶塞3.15ml离心管4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）或EDTA或两者混合液6.1NHCl7.4%NaHCO3四、操作步骤（一）贴壁细胞的消化法传代：1.吸除或倒掉瓶内旧培养液。2.D-Hanks液洗2～3次。3.向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。4.消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。5.吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。6.用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。7.计数，分别接种在新的培养瓶内。（二）悬浮细胞的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。离心传代法：1.将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；2.离心800～1000rpm，5min；3.弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；4.计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。(三)、部分贴壁细胞的传代部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。\n五、注意事项1.胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。2.离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。3.要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。审实验四细胞冻存和复苏一、目的学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。二、概述细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5.倒置相差显微镜6.培养箱7.液氮冰箱（二）玻璃器皿1.吸管（弯头、直头）2.培养瓶3.玻璃瓶（250ml、100ml）4.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.移液管（10ml）5.15ml离心管6.冻存管（1～2ml）（四）其他物品\n1.微量加样枪2.红血球计数板3.记号笔4.医用橡皮膏5.移液枪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.培养液4.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）6.1NHCl7.7.4%NaHCO38.DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3.离心1000rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3.离心，1000rpm，5min；4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5.次日更换一次培养液，继续培养。五、注意事项1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。审\n实验五细胞生长曲线、四唑盐试验（MTT）比色试验一细胞生长曲线（一）、目的学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。（二）、概述：细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。（三）、材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃）临床5.倒置相差显微镜6.培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）（二）玻璃器皿1.吸管（弯头）2.培养瓶3.玻璃瓶（250ml、100ml）4.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.24培养板4.胶塞（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.0.08%胰酶（四）、操作步骤1.取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2.计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。3.每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5d常要给未计数的细胞换液。4.以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。\n（五）、注意事项1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。二、四唑盐试验（MTT）比色试验（一）、目的学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。（二）、概述四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。（三）、材料（一）仪器1.净化工作台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃）5.倒置相差显微镜6.CO2培养箱7.振荡混合仪8.酶联免疫检测仪9.移液枪10.电磁力搅拌机11.微孔滤器（二）玻璃器皿1.吸管2.小烧杯（100ml）3.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.96孔培养板4.15ml离心管5.50ml离心管6.胶塞（四）其他物品1.微量加样枪2.红血球计数板（五）试剂\n1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.0.08%胰酶实现泪水汗水6.二甲基亚砜（DMSO）7.MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。（四）、操作步骤1.接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2.培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）3.呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4.比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。（五）、注意事项1．选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2．避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。3．设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。审实验六台盼蓝（trypanblue）排斥实验一、目的学习台盼蓝排斥实验的原理和方法二、概述台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。是最常用的检测细胞活率的方法。细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblue）染色法。三、材料1.显微镜、玻片、盖玻片、滴管2.试剂：0.4%台盼蓝染液：1)台盼蓝（Trypanblue）0.4g2)生理盐水100ml四、操作步骤1、将待染色细胞稀释至所需浓度。（方法及浓度范围与细胞计数相同）\n2、每0.1ml细胞悬夜约加新鲜配置的染液一小滴，室温下染3～5min。3、染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放在高倍镜下观察。4、死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。计数100～200个白细胞。统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活力。细胞活力（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数×100五、注意事项1.染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使检测结果偏低。2.另可结合细胞计数方法，同时进行细胞计数和活力检测。审实验七外周血细胞瑞氏（Wright）染色及计数一、目的掌握细胞瑞氏（Wright）染色及细胞计数方法二、概述瑞氏染料中有美蓝和伊红两种成分，前者为碱性，后者为酸性，它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调。血细胞核由去氧核糖核酸和强碱性的组蛋白、精蛋白等形成核蛋白。这种强碱性的物质与瑞氏染料中的酸性染料伊红有亲和力，所以染成红色；核蛋白中还有少量的弱酸性蛋白，它们又与染液中的碱性染料美蓝起作用而染成蓝色，但含量太少，蓝色反应极弱，故核染色呈现紫红色。较幼稚的细胞之胞浆和细胞核之核仁中含有酸性物质，它们与染料中的碱性染料美蓝有亲和力，故染成蓝色。三、材料及试剂（一）、瑞氏染料1、瑞氏染料（粉）1g2、纯甲醇（二级以上）600ml（二）、缓冲液1.1%磷酸二氢钾30ml2.1%磷酸氢二钠20ml3.蒸馏水加至1000ml在没有缓冲液的情况下，可用蒸馏水代替，但着色不如缓冲液满意。四、操作步骤1.制作血涂片滴一小滴血（约5ul）于干净玻片上，推片与玻片应呈约30°角，用力均匀而较快，且不可复推。如血滴较小，推得较慢，角度小于30°，所制涂片较薄；如血滴较大，推得较快，角度比30°大时，则所制涂片较厚。2.将标本放平（最好置于一个固定架上），用滴管将染液滴于涂片上，可用滴管将染液驱散，使其布满整个涂片。染液布满整个涂片后，稍等片刻或立即加入缓冲液，并使缓冲液与染液混均匀。3.染液与缓冲液的比例：染液量要充足，否则染液很快蒸发，将染料沉淀于细胞上。染液与缓冲液的比例为1：2~4左右比较合适，稀释度越大，染色时间越长，细胞着色较好，反之则越差。4.染色时间：视具体情况而定，一般约需10~30分钟。\n1.冲洗：用自来水冲洗涂片上之染料。2.显微镜检查：待自然干燥后用光学显微镜检查.五、正常血细胞形态1.成熟红细胞：正常红细胞为两面微凹而呈盘状，染色后则呈中心浅染之桔红色细胞，平均直径7.6um。2.成熟中性粒细胞：PB中有两种，杆状核和分叶核。杆状核粒细胞形态：圆形或椭圆形，直径10~13um。胞核如杆状、带状，胞核之凹超过假设核圆径的3/4，而且两端的内外有相当一段的平行。染色质凝固成块状，着色不均匀，其间可有空白区。胞浆内已不含有嗜碱性物质，而满布中性颗粒。中性分叶核粒细胞：圆形，直径10~13um。核呈分叶状，少者分两叶，多者六、七叶以上，叶与叶之间有细丝相连或完全断开，或互相重叠。染色质成细块状。胞浆内布满中性颗粒。3．成熟淋巴细胞：圆形，直径5~18um。核圆形或拟蚕豆状，染色质致密成团块状。胞浆量少，蓝色，可有少许圆形、周边整齐的嗜天青颗粒。大淋巴细胞胞浆量多，呈淡蓝色4.单核细胞：圆形或不规则形，直径12~20um。胞核居中或偏一侧，其形不规则。染色质凝集如筛底状或粗线条网状，但无凝集的块状染色质。胞浆量多，灰蓝色，散布许多细小的粉红色颗粒，颗粒多者甚至使胞浆成为粉红色，可有空泡和外浆出现。5.血小板：正常血小板为星形、逗点状或不规则状，直径2~5um，呈淡蓝色，中央推聚干淡紫红色的小颗粒。审实验八核蛋白的免疫荧光定位一、目的学习免疫荧光定位技术，定位细胞核蛋白。二、概述免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。三、材料1.荧光显微镜2.22×22mm1.5号盖玻片3.载玻片4.100%甲醇5.1%normalgoatserum(NGS)inPBS6.一抗：鼠抗人增殖细胞核抗原抗体（Proliferativecellnuclearantigenantibody,PCNA）7.二抗：FITC标记的羊抗鼠IgM四、操作步骤1.在22×22mm的1.5号盖玻片上培养细胞。理想条件下细胞应长到50%-70%汇合。2.在-20℃用100%甲醇固定细胞3分钟。3.用PBS+1%NGS洗三次，每次10分钟。4.在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。如果用22×\n22mm盖玻片，则在盖玻片上加30ul稀释的抗体，并且将盖玻片倒置在玻璃载玻片上，然后将载玻片放到湿盒里，在室温温育。1.用PBS+1%NGS洗三次，每次10分钟。2.在湿盒里与稀释为4ug/ml的荧光标记二抗室温温育1小时。3.用PBS洗四次，每次10分钟。4.用封片剂将盖玻片封在载波片上，用干净的指甲油将盖玻片封边，防止盖玻片滑动。五、注意事项1.要在盖玻片一边角落做记号，以知道细胞在盖玻片的那一面。2.一抗的浓度需要经过实验摸索确定。审实验九TOTALRAN提取一、目的掌握RNA的提取过程二、概述有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。三、材料及试剂1.InvitrogenTriZOLRNA提取试剂盒2.异丙醇3.70％酒精4.DEPC5.低温离心机四、操作步骤1.全血细胞：溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBCLysisSolution900ul的1.5mlEP管,室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000～16000rpm离心20秒。弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。2.组织细胞：将冻存或新鲜的组织，加入液氮让组织块完全冷冻，充分碾磨。加入1ml的TriZOL，分混匀，室温静置5min。3.取106-7细胞加入1ml的TriZOL中，充分混匀，室温静置5min。4.再加入200ul的氯仿，充分混匀，室温静置5min。4℃，13000rpm离心15min。5.取上清液500ul，加入等量的异丙醇。充分混匀室温静置5min。4℃，13000rpm离心10min。6.弃上清液，加入75%的酒精500ul，4℃，13000rpm离心10分钟。7.弃上清液，加入20ul的DEPC水，混匀。8.紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。五、注意事项所有的组织中均存在RNA酶,\n人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA3'末端含有多聚(A)+的特点,当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。审实验十基因组DAN提取一、目的掌握提取DNA原理及方法二、概述DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。苯酚/氯仿作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA提取试剂盒出售。三、材料及试剂1.GENTRODNA提取试剂盒2.异丙醇3.70％酒精四、操作步骤（一）、从全血中提取DNA1.溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBCLysisSolution900ul的1.5ml\nEP管,室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000～16000g离心20秒。1.弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。2.加300ul的CellLysisSolution于EP管中,充分混匀。3.加100ul的ProteinPrecipitationSolution于EP管中,充分混匀。13000～16000g离心3分钟。4.取上清液，加300ul的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000～16000g离心1分钟。5.弃上清液，加入70%的酒精500ul，13000～16000g离心1分钟。6.弃上清液，加入DNAHydrationSolution50ul,充分混匀，65℃5分钟使DNA完全溶解。7.紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。（二）、从组织中提取DNA8.取液氮冷冻的叶片2-3片，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。9.将粉末放入到1.5ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul,充分混匀。10.将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。11.取出离心管,每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm,10分钟。12.上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm,6分钟。13.将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。14.勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul1xTE中。15.加入3ulRNA酶溶液，37℃保温1小时。16.加入等体积的酚-氯仿溶液,轻轻混匀后,10000rpm离心6分钟。17.取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。18.取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。19.轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA,用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。20.依所提DNA量加入20-50ul的1xTE溶解DNA。21.测定DNA的浓度，取少量样品跑电泳,Agarose胶的浓度为0.8%。22.样品在4℃下保存备用。附:提DNA所用试剂配方：1.1.1MTris.Cl (1L：800mlH2O中加121.1gTris,用HCl调pH至8.5后定溶至1升，灭菌)2.0.5MEDTApH8(1L:800mlH2O中加186.1gEDTANa22H2O，用NaOH调pH至8.0，定溶至1升)3.20%SDS  (2L:在2L热水中缓慢加400gSDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存)4.5MNaCl(1L:750mlH2O中加292.2gNaCl，溶解后定溶至1升，灭菌)5.5.缓冲液“S”配1L缓冲液“S”1)100mMTris.ClpH8.51MTris.Cl100ml2)100mMNaCl5MNaCl20ml3)50mMEDTApH8.00.5MEDTA100ml4)2%SDS20%SDS100ml5)H2O680ml6.100xTE(1L:800mlH2O中加121.1gTris,37.2EDTANa22H2O,用HCl调pH至\n8.0,定溶，灭菌)1.50xTAE(1L:500mlH2O中加242gTris，溶解后加100ml0.5MEDTApH8.0和57.1ml冰醋酸，定溶)2.蛋白酶K溶液的配制(用20mMTris.Cl,pH8,2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul的蛋白酶K溶液；或用超纯水配制成相同的浓度)3.RNase(用水溶解RNase,终浓度10mg/ml,煮沸20分钟，缓慢冷却，分装，-20℃下保存)4.10.3MNaAcpH5.2  (1L:600mlH2O中加入408.24gNaAc3H2O,溶解后，用冰醋酸调pH至5.2，然后定溶1L，灭菌)五、注意事项不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA审实验十一质粒DNA提取一、目的掌握提取质量DNA提取的原理及方法二、概述质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。三、试剂及材料1.AIQprepminiprep质粒纯化试剂盒2.离心机四、操作步骤1.从1-5ml的过夜培养的LB培养基中分离大肠杆菌，将管底的沉淀用枪头轻轻打匀。将250ul的bufferP1加入含细胞悬液的EP管中，混匀至不见细胞团块。2.加入250ul的bufferP2轻轻混匀4-6次。（时间少于5分钟）3.加入350ul的bufferN3入EP管中，即刻轻轻混匀4-6次。4.13000g离心10分钟。5.将离心后的上清液加入QIAprep管中。13000g离心30-60秒。弃液体。6.加入0.5ml的bufferPB入QIAprep管中，13000g离心30-60秒。弃液体。7.加入0.75ml的bufferPE入QIAprep管中，13000g离心30-60秒。弃液体。再13000g离心60秒，去除残余的液体。8.将QIAprep管置于1.5ml的EP管上，加入50ul的bufferEB溶解DNA，静置1分钟，然后离心1分钟。审实验十二核酸纯度、浓度与分子量测定一、目的了解测定核酸浓度、纯度的原理和操作方法。。二、概述\n凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。线性DNA样品在凝胶中的迁移率与DNA的对数值成反比，可在电泳中加入核酸分子量标准来确定电泳后核酸的分子量。溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种荧光染料，在凝胶电泳中，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。同时核酸最大吸收波长在260nm，在此波长下，吸光度1A相当于一定浓度的核酸，可以通过A260/A280的比值，来测定所得核酸的纯度。三、材料电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉，琼脂糖，TBE电泳缓冲液，TEbuffer，溴化乙锭（EB），载样缓冲液，紫外分光光度仪，凝胶图象分析仪等四、操作步骤（一）、紫外分光光度（Spectrophotometer）法：1.将分光光度计打开，预热10分钟。2.将核酸溶液中取2µl，加（或纯水）使体积成为100µl。3.将稀释溶液加入石英管，以TEbuffer（或纯水）为标准倒入另一管。4.在波长260、280nm处测定吸光值。5.比较在260nm及280nm之读值。（三）Ethidiumbromide染色法：利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50ng/ml），或已知浓度的DNAmarker，和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳，以EB染色后，在凝胶图象分析仪上观察，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA的含量；比较DNA样品与DNAmarker条带位置，推知DNA样品分子量。实验步骤主要包括制胶、点样以及电泳等过程。1.称取1.5g琼脂糖加入盛有100ml0.5×TBE电泳缓冲液三角瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。加入溴化乙锭（EB）至终浓度0.5ug/ml，并摇匀。2.用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固。3.充分凝固后撕掉两端的胶布，垂直向上小心拔出梳子，以保证点样孔完好。凝胶置入电泳槽中，加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。4.用移液器吸取DNA样品8μl与2μl的载样缓冲液混匀，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10μlDNAMarker作为分子量标准。5.打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到条带由负极向正极移动，约半小时后即可观察。6.在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小；同时比较标准浓度及未知浓度的亮度，求取DNA的含量。五、注意事项\n1、A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8，表示纯度低，这时由OD260测得的DNA含量较不可信，核酸溶液中含有较多蛋白质，因此最好将前述所得核酸再重新抽取。2.测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：1)dsDNA(doublestrandedDNA)=50mg/ml2)ssDNA(singlestrandedDNAorsimgle-strandedRNA)=40mg/ml3)oligonucleotide=33mg/ml3.EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。审实验十三重组质粒DNA转化大肠杆菌一、目的掌握外源DNA片段和质粒载体的连接反应的方法。二、概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb＝且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中,如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。三、材料及试剂（一）、材料1.外源DNA片段:自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知。2.载体DNA:pBS质粒(Ampr,lacZ),自行提取纯化,浓度已知。3.宿主菌:E.coliDH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。1.设备2.恒温摇床3.台式高速离心机4.恒温水浴锅5.琼脂糖凝胶电泳装置6.电热恒温培养箱7.电泳仪无菌8.工作台9.微量移液枪10.eppendorf管（二）、试剂1.LB固体和液体培养基2.T4DNA连接酶(T4DNAligase)；购买成品。3.X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。\n1.IPTG储液(200mg/ml):在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。2.含AmpLB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。3.含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40ulX-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。4.感受态细胞制备试剂　四、操作步骤(一)、连接反应1.取新的经灭菌处理的0.5mleppendorf管,编号。2.将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。3.加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。4.加入10×T4DNAligasebuffer1μl,T4DNAligase0.5μl,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。5.同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。（二）、E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化　　每组连接反应混和物各取2μl转化E.coliDH5α感受态细胞。（三）重组质粒的筛选1.每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。2.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。3.不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在LB筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在LB选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。（四）、酶切鉴定重组质粒1.用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp50μg/ml的5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。2.使用快速分离质粒DNA直接电泳，同时以抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。3.再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。4.还可用杂交法筛选重组质粒。5.PCR法五、注意事项1.DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。3.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。\n1.在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。2.LB选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。3.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。4.在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。审实验十四大肠杆菌感受态细胞的制备一、目的掌握大肠杆菌感受态细胞的制备二、概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。　　。三、材料及试剂（一）、材料1.E.coliDH5α菌株（Rˉ,Mˉ,Ampˉ）2.pBS质粒DNA:购买或实验室自制3.eppendorf管。（二）、设备恒温摇床电热恒温培养箱台式高速离心机无菌工作台低温冰箱恒温水浴锅制冰机分光光度计\n微量移液枪。（三）、试剂1.LB固体和液体培养基2.Amp母液3.含AmpLB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板4.0.05mol/LCaCl2溶液:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。5.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。四、操作步骤（一）、受体菌的培养1.从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。2.将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1.将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。2.弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。3.弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4.感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。（三）、转化1.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2.加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3.42℃水浴中热休克90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4.向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。5.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。6.同时做两个对照:a)对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。b)对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。（四）、计算转化率1.统计每个培养皿中的菌落数。2.转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：1)转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积2)转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)3)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积4)感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数\n五、注意事项1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。5.本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。审实验十五PCR及RT-PCR一、目的掌握聚合酶链式反应(PCR)及逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在由TaqDNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。反应时它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reversetranscrip－tion,RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。\n在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。RNA中即使含有极微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行。常用的逆转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosisvirus,AMV）和莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus,MO-MLV）的逆转录酶（RT）。一般情况下用Mo-MLV-RT较多，但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时，可改用AMV-RT，因后者最适温度为72℃，高于Mo-MLV-RT的最适温度（37℃），而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。　一步法扩增（onestepamplification）是为了检测低丰度mRNA的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD－NA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。三、材料（一）、仪器1.DNA扩增仪，亦称PCR仪2.台式高速离心机3.电泳仪、电泳槽4.PharmaciaBiotech公司的ImageMasterVDS凝胶成像仪（二）、塑料器皿Eppendorf管、Tip头（三）、其他物品1.微量加样枪(0.5〜10ul、5〜40ul和40〜200各1支)2.Eppendorf管架（四）、DNA模板含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液。虽然DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA(如基因组DNA)时，若用切点罕见的限制酶(SalI或NotI)先进行消化，则扩增效果更好，闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此用质粒作反应模板时最好先将其线状化，但这也不是非常必要。模板DNA中靶序列的浓度因情况而异，而且往往非实验者所能控制。尽管如此，仍值得按已知靶序列量递减(1ng、0.1ng、0.01ng等)的方式设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。（五）、试剂1.10×PCR缓冲液(不含MgCl2)2.5mmol/LdNTPs,4种dNTP每种浓度均为2.5mmol/L3.TaqDNA聚合酶(5u/ul)4.MgCl2，25mmol/L5.5×TBE电泳缓冲液6.10g/L溴化乙锭7.1%〜2%琼脂糖凝胶(浓度视待扩增的DNA片段大小而定)8.两对套叠式引物四、操作步骤\n(一)、以DNA为模板的PCR扩增反应1.按以下次序，将各成分在0.2mlEppendorf管中混合：1)模板DNA(100mg/L)5.0ul2)10×PCR缓冲液5.0ul3)2.5mmol/LdNTP4.0ul4)引物(5’端,30pmol/L)1.0ul5)引物(3’端,30pmol/L)1.0ul6)MgCl2(25mmol/L)3.0ul7)Taq酶(5u/ul)0.3ul。8)用灭菌双蒸馏水补足体积至50ul2.将溶液混匀，15000r/min离心10秒钟。3.用50ul轻矿物油覆盖于反应混合液上，防止样品在重复加热－冷却过程中蒸发(这步可省略)。4.按以下方法进行扩增。典型的变性、退火和延伸条件如下：循环变性退火延伸首轮循环94℃5min55℃1min72℃1min后续循环94℃1min55℃1min72℃1min末轮循环94℃1min55℃1min72℃7min5.末轮循环后不再变性，15000r/min离心2min，将反应物转入另一小管中，置-20℃保存。6.从反应混合液中取出扩增产物DNA进行凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列测定分析。（二）、以mRNA为模板的PCR扩增反应1.设置合成cDNA第一链的反应：1)4×扩增缓冲液2.0ul2)2.5mmol/LdNTP2.0ul3)Oligo(dT)12-18(100mg/L)0.5ul4)RNAinhibitor20U5)mRNA1ul6)25mmol/LMgCl22ul7)加水至终体积20ul*可用10-50pmol随机引物代替Oligo(dT)作为引物。2.将溶液混匀，以15000r/min离心10秒钟，将反应混合液置65℃变性5min，使mRNA均变为单链。3.将100-200单位MMLV反转录酶加入混合物中，混匀，将反应混合物置37℃温育30min。4.将温育后产物cDNA取出一部分按照以DNA为模板的PCR扩增反应步骤进行预定循环数的扩增反应。五、注意事项1.PCR引物摩尔数的计算在PCR反应中，引物的量是以pmol数表示的，而合成引物后，引物的量是以OD值表示的。因此，需经适当换算，才能配置适当浓度的引物溶液。换算公式如下：1)OD值为1的引物约为33ug。2)引物的分子量=碱基数×3303)引物pmol数=OD值×33×1000000=OD值×1000004)碱基数×330碱基数×330\n1.结果假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：TaqDNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或doublePCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。2.结果假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。章审实验十六DNA探针的标记一、目的学习DNA探针标记的方法，为核酸的分子杂交提供基础二、概述分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信号强，所以最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β射线的能量太低，只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点，近年来，人们在寻找非放射性标记物方面取得了很大进展。国内已具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出售。目前非放射性标记物有下述几类：金属如Hg、荧光物质如FITC、半抗原如地高辛、生物素、酶类如辣根过氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等，不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。　　核酸探针的常用酶促标记技术有：缺口平移；DNA快速末端标记；用T4多核苷酸酶标记DNa5'末端，随引物延伸法；PCR法等。本实验用随机引物延伸标记法以地高辛、生物素等标记EGFR基因片断。dsDNAssDNA变性+加入随机序列引物加入DNA聚合酶及含有标记dNTPs引物延伸变性获得标记探针\n+随机引物延伸法制备标记DNA探针概述示意图三、材料1.eppendorf管及Tip头2.PCR仪3.标记笔、镊子、无粉手套4.EGFR-PCR产物5.地高辛标记试剂盒（DIG-RandomLabelingMix,RabbitantiDIG,Biotinlated-Goat-Anti-Rabbit-IgG,SABC-POD,DABStockingbuffer,Blockingreagent）6.washingbuffer(0.1MMaleicacid,0.15MNaCl;pH7.5(20°C);0.3%(v/v)Tween20)7.Maleicacidbuffer(0.1MMaleicacid,0.15MNaCl;adjustwithNaOH(solid)topH7.5)8.Detectionbuffer(0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,pH9.5)9.TEbuffer(10mMTris-HCl,1mMEDTApH8.0)10.微量加样器等。四、操作步骤1.灭菌去离子水稀释1ugDNA至总体积16ul。2.DNA热变性：DNA样品于PCR仪中100℃变性10min，后迅速置于碎冰中3min以上。3.加4ulDIG-RandomLabelingMix，混匀后离心2000rpm×5min（4℃）。4.PCR仪37℃反应过夜。5.加2ulEDTA终止反应，标记结束。标记物-20℃保存>1年。五、注意事项1.用于标记的DNA模板尽可能纯化，以提高标记效率2.模板DNA>100bp。3.经DIG标记的探针不能用酚/氯仿抽提纯化4.根据说明书确定标记效率（标记探针及试剂盒阳性对照DIG标记DNA梯度稀释，尼龙膜点样，样本变性，封闭，杂交，现色定量）5.本法亦可用于单链DNA或RNA\n探针的标记，当标记RNA探针时，需采用逆转录酶，收获产物为标记的单链cDNA。1.可根据下表标记产物DNA摸板量（ng）标记1小时产物（ng）标记20小时产物（ng）104560030130105010027015003004502000100008502300300013502650审实验十七Southernblot一、目的学习Southernblot技术及其应用二、概述1975年E.Southern发明了将DNA切开，电泳分离，再变性，印迹到硝酸纤维（NC）滤膜上，用探针进行杂交，检测DNA的方法。自显影或显色用于DNA分析。以32P标记放射性探针为例，放射自显影观察结果。互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性标记的探针与被固定的模板杂交，经显影或现色后检测出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：Southern杂交、Northern杂交、点杂交、缝隙及原位杂交。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。本实验包括基因组DNA限制性内切酶切，DNA电泳及转膜，杂交及检测三部分。三、基因组DNA限制性内切酶酶切（一）、试剂及材料1.EcoRl内切酶及反应buffer2.基因组DNA或PCR产物等样品3.去离子水4.eppendorf管及Tip头5.PCR仪6.标记笔、无粉手套等（二）、操作步骤：1.设置50ul反应体系，在200ulEP管中加入：10ug基因组DNAxul去离子水49-xul\n10×buffer5ulEcoRl4ul1.充分混匀，离心20S。2.置于PCR议上37℃反应过夜3.加1/10体积乙酸钠、2体积无水乙醇沉淀DNA晾干4.加20ulTEbuffer溶解DNA四、DNA琼脂糖凝胶电泳（一）、试剂及材料1.电泳级琼脂糖2.10×TBE（0.89MTrisbase,0.89M硼酸,20mMEDTA）3.10mg/mlEB（诱变剂，4℃避光保存）4.DNA酶切样本5.6×DNAlandingbuffer（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）6.水平电泳仪（二）、操作步骤1.用0.5×TBEbuffer配制0.8％琼脂糖凝胶，微波炉加热至溶化，加入EB（0.5ug/ml）混匀后倒入制胶器中室温凝固。2.凝固后，去除样品梳及胶带，置于水平电泳仪中。3.将DNA样品用6×DNAlandingbuffer混匀后加入样品孔中，恒压电泳（20V/10mA）直至染料电泳至边缘。4.电泳完毕，取出凝胶切角并在凝胶成像系统成像记录。微型水平琼脂糖电泳槽效果图五、DNA转移与固定（一）、试剂及材料1.2MHCl2.变性液（0.4MNaOH）3.20×SSC转移液（3mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠,用1mol/LHCl调节pH至7.0）4.转移槽5.吸水纸及滤纸、尼龙膜等（二）、操作步骤1.凝胶置于0.25MHCl中处理30min，去离子水洗1次。2.碱变性：凝胶置于0.4MNaOH变性液中作用20min。3.毛细管法转移：根据凝胶大小裁剪与其等大小尼龙膜、滤纸片，尼龙膜一角软铅笔作方位标记4.去离子水浸泡尼龙膜、滤纸片，中再浸泡5min。5.按下图安装转移槽进行转移过夜(0.4MNaOH转移液)。\n1.转移完毕后取出尼龙膜，2×SSC浸泡5min，滤纸吸干，夹在2层干净滤纸。毛细管法转移DNA示意图六、预杂交与杂交（一）、试剂及材料1.DIGEasyHyb工作液2.杂交炉（二）、操作步骤1.预杂交:将尼龙膜置于预热DIGEasyHyb工作液（37℃-42℃）中摇晃充分作用30min。2.探针变性：DIG标记探针煮沸5min后迅速置于碎冰中，用预热DIGEasyHyb工作液制备含探针的杂交液。3.弃去预杂交液，加入杂交液42℃摇动孵育4小时或过夜。4.2×SSC（in0.％SDS）洗膜2次（5min×2）.不断摇动。5.5×SSC（in0.％SDS）洗膜2次（155min×2，65-68℃），期间不断摇动。七、杂交检测（一）、试剂及材料1.Washingbuffer2.maleicacidbuffer`3.detectionbuffer4.TE-buffer5.blockingbuffer(见DNA探针标记实验)6.antibodybuffer7.color-substratesolution（二）、操作步骤1.Washingbuffer润洗1遍（3-5min）。2.100mlblockingbuffer工作液封闭30min。3.100mlantibodybuffer(1:5000)孵育30min。4.Washingbuffer洗膜（15min×2）5.20mldetectionbuffer平衡2-5min。6.将尼龙膜置于10mlcolor-substratesolution棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不要摇动）。7.当出现条带时，TE-buffer洗膜（5min×1），终止现色。8.照相记录，80℃烤干，储存。\n1.扫描计算EGFR基因扩增的倍数八、注意事项1.为了防止缓冲液流从凝胶边缘之外通过，沿凝胶的每一边放置一条Parafilm膜，使滤纸桥与层叠上部的吸湿材料无法接触。2.核酸转移的选择尼龙膜比NC膜好，是目前较理想的核酸固相支持膜。3.尼龙膜漂洗尽量彻底，可降低背景。4.color-substratesolution要新鲜配制。5.Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/l)[l=lengthofhybridinbasepairs],Topt.=Tm–20to25°C(Thegivennumbersoftheequationwerecalculatedaccordingtoastandard(Thegivennumbersoftheequationwerecalculatedaccordingtoastandardequationforhybridizationsolutionscontainingformamide,50%.)TheactualhybridizationtemperatureTopt.forhybridizationwithDIGEasyHybis20-25°CbelowthecalculatedTmvalue.Topt.canberegardedasastringenthybridizationtemperatureallowsupto18%mismatchesbetweenprobeandtarget.Whenthedegreeofhomologyofyourprobetotemplateislessthan80%,youshouldlowerTopt.accordingly(approx.1.4°CbelowTmper1%mismatch)andalsoadjustthestringentwashingstepsaccordingly(i.e.increaseSSCconcentrationandlowerwashingtemperature).审实验十八NORTHERNBLOT一、目的学习NORTHERNBLOT技术，通过本实验了解NORTHERNBLOT的应用二、概述Northernblot的基本概述是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。三、试剂及材料1.水平电泳仪及电泳槽2.制冰机3.恒温水浴箱4.凝胶成像系统5.EP管、移液器及Tip头6.5×MOPS电泳buffer（0.2MMOPSpH7.0,0.25NaAc,5mMEDTA）7.甲醛凝胶加样buffer（1mMEDTA,0.25%溴酚蓝,50％甘油）8.EB9.DIG标记EGFR探针10.DIGEasyHyb工作液11.20×SSC（3mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠,用1mol/LHCl调节pH至7.0）\n1.鲑精DNA10mg/ml）四、操作步骤（一）、RNA转移与固定1.变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPSbuffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30min。2.按southernblot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。3.1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。4.RNA染色，干燥的尼龙膜先于5％冰乙酸中室温浸泡15min。后于0.5mol/L乙酸钠和0.04％亚甲蓝溶液中浸泡5-10min.去离子水淋洗膜5-10min，可见RNA标准及28S及18SRNA的条带，软铅笔标记。（二）、预杂交、杂交及显色1.Washingbuffer润洗1遍（3-5min）。2.100mlblockingbuffer工作液封闭30min。3.100mlantibodybuffer(1:5000)孵育30min。4.Washingbuffer洗膜（15min×2）。5.20mldetectionbuffer平衡2-5min。6.将尼龙膜置于10mlcolor-substratesolution棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不要摇动），当出现条带时，TE-buffer洗膜（5min×1），终止现色。7.照相记录，80℃烤干，储存。8.扫描计算EGFR基因扩增的倍数。五、注意事项1.避免RNA酶污染，防止RNA降解。2.凝胶中最好不要加入EB，以免降低杂交的效率3.为降低膜杂交本底，可适当延长预杂交时间。审