糖生物学基础

糖生物学基础

糖生物学研究概述摘要：主要介绍了天然植物多糖的结构、分离纯化方法、结构分析方法以及生物活性功能,如抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血糖、抗病毒、抗氧化等,展望了其发展前景。关键字：植物多糖结构分离纯化结构分析生物活性Abstacts：Thenaturalplantpolysaccharidestructure，isolationmethod，structureanalysismethodandthebiologicalactivityfunctionweremainlyintroduced，liketheanti-tumor,theimmunoregulation，antifatigue，hypoglycemic,theanti-virus,antioxidationandsoon.Itsprospectsfordevelopmentwerealsoforecasted.Keywords：PolysaccharidesstructureIsolationmethodStructureanalysisBiologicalActivities糖类是自然界分布最广、含量最多的有机化合物，也是自然界中分子结构复杂而且品系庞大的一类。它与蛋白质，脂类和核酸是四类重要的生物大分子，是地球上最重要的天然有机物之一，其占物质单位体积化学成分干重50%以上。糖是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质，其活性涉及到多细胞生命的全部时间和空间，如受精、着床、分化、发育、免疫、感染、癌变、衰老等领域。21世纪的今天，糖类的研究再次成为人们关注的焦点，糖已经不再是简单的被认为是能量来源和结构的基础了，其许多生物学功能逐渐被发觉，致使多糖成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分。1多糖的概念及分类糖类被界定为多羟基醛或多羟基酮的化合物，或是能水解出上述单位的前体化合物。其中依据其结构特点，将糖类分为单糖（不能再水解成更简单糖单位的糖）、寡糖（2-20个单糖单位通过糖苷键连接而成的糖类）和多糖。多糖是一类十分重要的生物高分子，是由20个以上单糖单位缩合、失水而连接起来的均聚物或共聚物，是自然界的糖类主要的存在形式。多糖是高分子化合物，相对分子量极大、范围广泛，从30000到400000000。标准不同，分类也有所不同。如根据生物来源大致可分为动物来源，植物来源和真菌来源多糖。而根据由一种还是多种单糖组成可分为同多糖和杂多糖。同多糖主要有纤维素、淀粉、糖原和甲壳质，杂多糖主要有Spharose、HA、Sephadex\n、硫酸软骨素、果胶、琼脂和肝素等。此外还有一些复合多糖可以分为糖肽类（糖蛋白，蛋白聚糖，肽聚糖），糖脂类(脂多糖、糖鞘脂和糖基酰基甘油)及其他比如核糖体。2多糖的结构多糖是一种大分子，其的结构虽不像蛋白质那样有清楚的分类标准，但同样可分为几个结构层次，称为初级、二级、三级、四级等结构层次，其基本含义与对应的蛋白质结构相同．同样是阐述多糖分子构象形态的基础亦与蛋白质大分于链型构造的原理和研究方法相似。多糖的初级结构指线性链中单糖残基以糖苷键连接成序，不涉及次级的相互作用。具体地说，其一级结构包括：（1）糖链中糖基的排列顺序（2）糖苷键的键型（α、β）及糖基的构型（D、L）（3）相邻各糖基是如何形成糖苷键的，是通过哪位碳原子上的羟基缩合；（4）多糖是否为直链，无分支结构，如有分支，是哪位碳原子连接的。研究发现，多糖的空间结构、性质及其功能取决于多糖的一级结构，一级不同，其空间结构和功能也不同。多糖的二级结构指的是多糖主链间以氢键结合形成聚合体，常见的二级结构有三种，带状的、螺旋状的和无规卷曲的。同时要说明的是，多糖的二级结构形式也主要依赖于一级结构。具有二级结构的多糖链（包括糖苷键和侧链）在一定程度上可以着成是一个组成单位，它们的疏水性质，电荷性质，空间位阻等通常是不均一或不对称的，因此它们的链段还能与多糖分链的其他链段进一步相互作用，进而构成较紧密的结构形式即三级结构，三级结构的形式主要由螺旋与螺旋、螺旋与带状、带状与带状之间的作用形成。多糖的四级结构指三级结构的基础上，多聚链间以非共价链结合形成聚集体，这种现象常称为亚单位现象。多糖链在形成固有三级结构之后．分子表面仍存在一些可以和其他多糖分子链相互作用的基团，它们之间相互作用可以装配成功能更为完善的体系，这样的组合和结构方式形成的是多糖的四级结构。3植物多糖的研究概况3.1植物多糖的分离纯化\n多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱或稀盐溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。一般植物多糖多采用热水提法，此法提取简单，破坏性小且得率高。提取得到的多糖往往含有其他干扰物质，其中最常见的是蛋白质。除蛋白质的方法有很多种，常用的有Sevag法、三氟三氯乙烷法或三氯乙酸法,这些方法可以有效的去处游离蛋白，而结合蛋白最好用酶法，作用力较温和，不易破坏连键。含色素较高多糖往往需脱色处理。常用的脱色方法有:离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)。其中DEAE-纤维素是目前最常用的脱色方法，操作简单，省时经济，对多糖结构无影响，而H2O2易引起多糖的降解，吸附法易损失多糖，对于同时除去游离蛋白质和色素的多糖,可通过生成金属络合物的方法,其他方法不常用。多糖的分级是研究多糖结构和多糖活性的基础，运用适当的分离方法可以得到分子量均一且极性均一的多糖，以便对多糖结构进行准确的分析。多糖纯化方法主要有利用不同多糖分子大小和溶解度不同而分离的分级沉淀法及利用分子量或电荷不同而将多糖有效分离的柱层析法。柱层析又根据装柱材料分为分子筛排阻层析法、离子交换柱层析、亲和层析等等。凝胶柱层析主要是利用分子量的大小差异将多糖进一步纯化方法，是一种分辨率低、载样量少的分离技术，但方法简单、快速。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose),以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂,从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化,但不适宜粘多糖的分离。一般粗多糖样品的纯化多用Sepharose、Sephadex、DEAE-Toyopearl和Sephacryl精制得到各种多糖。离子交换层析法是通过载体表面带电基团与样品离子和洗脱液所带电荷离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸附实现色谱分离。不同多糖尤其是多糖与蛋白质结合的复合多糖，根据所带电荷不同，调节pH在一定条件下,进而将各多糖上电荷的差异而达分离目的。多糖的纯度不能用普通化合物的纯度标准来衡量，因为多糖是极其复杂的生物大分子，即使是纯品其微观也是不均一的，多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。因此多糖是否均一，要选择透析、超滤、电泳、比旋光度、超速离心和高效液相色谱等方法中的两种以上来综合评定。通过苯酚-硫酸法或蒽酮-\n硫酸法测定总糖含量、间羟基联苯法测定糖醛酸含量是含量测定的主要方式。苯酚－硫酸试剂可与游离的单糖、寡糖或多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，样品加入试剂反应后在波长490mn处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。此方法简单、灵敏，颜色持久且每种糖仅需一条标准曲线。蒽酮-硫酸法糖类遇浓硫酸脱水生成的糠醛或其衍生物可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620mn处有最大吸收。显色的吸收值与多糖含量同样呈线性关系。但色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应会有一定于扰[4]。利用间羟基联苯法测糖醛酸含量。其实验原理为聚己糖醛酸与四硼酸钠硫酸溶液可以在高温条件下水解，水解产物进一步与间羟基联苯反应，生成红色衍生物，在525nm处有最大紫外吸收，在一定浓度范围内，其吸光度与糖醛酸的浓度成线性关系。3.2多糖的结构研究由于多糖的结构非常复杂，也因受到研究手段发展的限制。目前我们采用的结构研究方法主要集中在结构描述和分析两方面。多糖的结构描述方面主要注重于单糖的组成、分子量范围、连接点类型、单糖和糖苷键的构型及重复单元等的研究。多糖结构的分析方面主要有甲基化分析法、高碘酸氧化法、Smith降解法、酸碱部分降解法和特定酶的降解法等。近几年高效毛细管电泳也被应用于糖结构的分析。随着现代仪器的发展，物理分析方法同样在多糖结构分析中占有重要的地位，如红外光谱、核磁共振及质谱分析等。分子量测定常用超过滤法、粘度法、渗透压法、高效凝胶渗透色谱法、高效液相法、还原末端法及聚合度法。多糖的结构分析首先要对其单糖组成有一定的理解，将完全酸水解或部分酸水解后的单糖进行气相、液相色谱，得到单糖组成的分析图，这是多糖链组成成分分析的主要手段。此方法为下一步对多糖结构的分析提供基本的依据。在测定单糖组成的同时，近来应用高效凝胶色谱分析多糖的分布状态及分子量，其优点是可以直接进样而不需衍生，操作简便，且分辨率高，分子量测定较准确。\n其次，每一种化合物都具有其特殊的红外光谱，因此我们应用红外光谱测定糖的吡喃或呋喃环形式，也可以运用此方法鉴定多糖的结构，提供有关糖环上的取代基和异头碳构型的信息。高碘酸氧化和Smith降解是最常见的分析多糖结构的经典方法。高碘酸氧化可以选择性地断裂糖分子中连二或连三羟基处，生成相应的多糖醛，甲醛或甲酸。这种方法除了可以用于测定直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目以外，还可用来确定糖苷键的位置。Smith降解通常与高碘酸氧化结合进行，将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解，糖基之间以不同的位置缩合，因此用高碘酸氧化后则生成不同的产物，从这些降解产物中，可以获取多糖的结构信息，从而达到对糖的结构分析。甲基化的方法很多，近年常用Hakomori法，其原理是用甲基化剂将糖中的羟基甲基化成甲醚，然后水解产生部分甲基化的单糖，鉴定这些甲基单糖产物，从而推测组成寡糖或多糖分子中单糖间连接的位置。核磁共振法是近年来应用广泛，对糖结构分析较准确的一种研究手段。可分为13CNMR谱和1HNMR谱,且前者更为常用。13CNMR的化学移范围较1HNMR为广，其化学位移可达到200PPM。所以共振讯号分得开，不但能确定各种碳的位置，而且还能区别分子的构型和构象。除此之外，GC-MS、质谱、快原子轰击质谱、毛细管电泳等也得到不同程度的应用;而除化学方法外，生物学上利用特异性糖苷酶进行的酶法分析方法也得到了不同程度的应用。4植物多糖的生物活性4.1增强机体免疫功能植物多糖最为突出而普遍的功能就是其对机体免疫功能加强,而这种功能的发挥主要通过以下途径来实施的。（1）激活巨噬细胞由于巨噬细胞在抗肿瘤和抵御各种感染方面具有主要作用,因而激活巨噬细胞可提高机体抗肿瘤和抗病毒的能力。许多植物多糖都能激活巨噬细胞,增强其吞噬功能和机体的特异性。如人参多糖具有显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能,激活网状内皮系统(RES),并且对实验性小鼠肿瘤有抑制作用。高梅等研究发现,猪苓多糖通过激活巨噬细胞合成与释放单核因子活化淋巴细胞,从而增强机体对肿瘤细胞的免疫应答作用。\n（2）激活T和B淋巴细胞有些植物多糖能刺激T细胞增殖,并能显著增强体液免疫功能。香菇多糖是一典型的T细胞激活剂,它在体内和体外均能促进特异性T淋巴细胞(CTL)的产生,并提高CTL的杀伤活性。仙茅多糖对成熟的T细胞有明显促进增殖作用。东当归多糖可激活B细胞,使之分化成抗体生成细胞。（3）促进细胞因子生成多糖也可以通过激活巨噬细胞,树突状细胞,和淋巴细胞等促进IL-1,IL-2,IL-6,TNF等细胞因子的表达与分泌来增强免疫应答能力。如枸杞多糖能明显增加IL-2的产生和增加IL-2R的表达,显著增加巨噬细胞C3b和Fc受体的数量和亲和力,促进合成IL-1和TNF,从而发挥其免疫作用和免疫调节作用。（4）激活补体补体是血液中具有酶原活性的蛋白质系列,能协同抗体或协助吞噬细胞来杀灭病原微生物。许多高等植物的多糖均具有激活补体作用。黄芪多糖和党参多糖对正常豚鼠虽无影响,但对经过处理补体下降、吞噬率下降的豚鼠,则有促进补体恢复功能,并能促进中性白细胞吞噬率恢复和提高。4.2抗肿瘤作用自从1950年发现酵母多糖具有抗肿瘤效应以来,已分离出很多具有抗肿瘤活性的植物多糖。就多糖的抗肿瘤作用而言,可将抗肿瘤多糖分为2类:一类是具有细胞毒性的多糖直接杀死肿瘤细胞,如牛膝多糖,可提高NKC活性,诱生TNF,抑制实体瘤;第二类是作为生物免疫反应调节剂通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞,如商陆多糖能增强Mφ活性,增强免疫,抑制小鼠S180肉瘤。随着对多糖结构和活性研究的不断深入,以及对多糖作用机理与结构关系的进一步阐明,植物多糖多样的生物活性得到了广泛的研究,而且已经成为当今新药的发展方向之一。加强糖生物学的基础研究,加大糖工程产品的开发力度,将会使更多的植物多糖生物活性应用到临床,造福于人类。