气相色谱检查法标准操作规程

气相色谱检查法标准操作规程

文件气相色谱检查法标准操作规程编号SOP•09•1016版本2页码1/11编制日　期替代∕审定日　期颁发质量保障部批准日　期生效年1月20日发放质保中心目的：规范气相色谱法的操作，确保检验结果的正确性。范围：气相色谱法1．简述气相色谱仪是以气相色谱法原理为基础而设计的仪器。填充柱式气相色谱仪是将固定液涂布于惰性载体上，装入玻璃或不锈钢材料制成的色谱柱内。毛细管柱气相色谱仪多用将固定液交联或键合于空管弹性石英毛细管内壁，称作融熔石英空心毛细管柱。流动相用气体，称为载气。仪器由气路系统、进样系统、柱分离系统、检测系统、上述三者的温度控制系统和数据采集系统所组成。气相色谱法分析固态及液态样品时，是在加温状态下使样品处于气态，在载体上的固定液和载气间进行分配分离。加温系统耗电量大，约2～3kw，故须有可供10～15A的电源，仪器接地应良好。2．仪器及性能要求2.1仪器应按国家技术监督局JJG700－90气相色谱仪检定的规程的要求作定期检定。2.2气路系统2.2.1气源载气的氮、氦、氢等。常用氮作载气。 氮纯度最好使用99.99%的高纯氮。但填充柱以氢火焰离子化检测器亦可用99.9%纯氮，氮多用6m3高压钢瓶装，按照高压容器安全操作规程操作。当气瓶气压下降到20kg/cm2时，应停止使用。由于氢有分子量小、热导系数大、粘度小等特点，因此在缺乏氦的情况下，常采用作热导检测器载气，在火焰离子化检测器中它是必用的燃气。为了提高载气的线速度，缩短分析时间，用毛细管柱分析某些样品时，可采用氢作载气、氮作尾吹、空气助燃的办法。氢的来源目前除了氢高压钢瓶外，还可采用氢发生器，但要用超纯水，以防钯管失效。即使如此，钯管寿命仍较短，有条件的地方以采用钢瓶氢为宜。氢易燃、易爆。使用时应特别注意安全，特别要注意气路的各联接部分的漏气检查。空气是氢焰检测器助燃气体，可用小型空气压缩机提供气源。2.2.2气路连接、气流指示和调节在安装气瓶减压阀时，应先将瓶口联结处的灰尘擦干净，将瓶口向外，旋阀门开磁放气数次，吹除灰尘，将减压阀用扳手拧紧，再用联接管将减压阀出口联至气相色谱仪。用表面活性剂溶液检查连接处气密性。为了保证色谱定性和定量分析的准确性，载气流量要求恒定（变化小于1%），在气相色谱仪中一般都采用减压阀、稳压阀和稳流阀串联使用，以控制气流的稳定。在使用这些阀时，输入压力应符合说明书的规定来维持压力的稳定。2.2.3气流的测量气体的流速是以单位时间内通过色谱柱或检测器的气体体积大小来表示（ml/min），通常使用转子流量计和压力表换算法，观察直观方便，但不太准确，比较准确的方法是用皂膜流量计，它可以直接准确测出气体的流量。采用2～3mm内径填充柱用氮气为载气时，流速在30～60ml/min之间。现代仪器有电子流量检测器和电子压力控制器，可编程控制柱头压力和载气流量。2.3进样系统进样量的大小、进样时间的长短，直接影响到柱的分离和最终定量结果。在药物分析中大多是液体进样。 2.3.1微量注射器的使用液体样品大都采用微量注射器进样，注射器取样后，针头刺入气化室进样口的密封硅橡胶垫，将液体样品推入气化室。为了达到进样重复性，在进样操作时必须注意：2.3.1.1要用同一根或校准过的微量注射器进样。2.3.1.2由于液体进样是用注射器刺入胶垫注入较高温度的气化室，针头内液体会因受热膨胀挤入气化室中，故每次进样操作应当一致，用同样方式和速度进样。以保证进样的准确和重现性。2.3.1.3使用前应检查注射器针尖光滑性，使用后必须及时清洗干净。2.3.2进样器2.3.2.1气化进样气相色谱液体进样需经加热使样品气化，由载气带入色谱柱，因此要有气化室。为了避免气化的样品与金属接触产生分解，一般气化室装有玻璃或石英的插管，此种进样方法使未气化物体残留在插管内，应不时取出插管更换或清洗。2.3.2.2柱上气化进样为了避免样品的热分解及气化室死体积对样品稀释与扩散作用，采用柱上气化进样，即色谱柱进口端一段不装填料，此段空管插入气化室，样品液直接注于填料上。此种进样法不适用于溶剂残留量测定，因其有大量不挥发供试品，结在色谱柱进口端。2.3.2.3毛细管色谱柱进样器分为分流进样和不分流进样。分流进样气化室内插管内径较不分流进样大，并具有分流调节阀，以便调节分流比，分去大部分样品，以免柱过载。 除分流以调节阀外，仪器另串联有分流截止阀于分流气路中。不分流进样则关闭此阀。常用分流进样方式是先将分流截止阀关闭，进样后等候一定时间打开分流截止阀分流。除有明确规定外，可根据予试选择最佳条件（如灵敏度、重复性、分离度等）进行。2.3.2.4进样密封硅橡胶垫应先加热老化，除去挥发性物质再用。2.4柱箱柱箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此要求柱箱控温精度在±1℃，柱箱温度波动小于0.1℃/h；温度梯度波动应小于使用温度的2%。温度控制分恒温和程序升温两种，前者用于简单组分分析，后者用于复杂多组分分析。2.5检测器气相色谱检测器有：火焰离子化（FID）、热导（TCD）、电子俘获（ECD）、火焰光度（FPD）、热电离（TSD）或称氮磷（NPD）检测器等。在药物分析中火焰离子化（FID）检测器是最常用的检测器。2.5.1FID检测器操作条件2.5.1.1气体流速FID检测器须用3种不同气体：载气、氢和空气，通常3种气体流速比约为：1：1：10为合适。使用毛细管柱时要增加补气，即在毛细管出口到检测器流路中增加补气的辅助气路，其目的是增加柱出口到检测器的载气速度，以减少这段死体积的影响，使灵敏度和峰形有所改善。2.5.1.2检测器温度温度对FID检测器的灵敏度和噪声的影响不显著，为了防止有机物冷凝，一般控制在比柱箱温度高30～50℃。此时氢在检测器中燃烧生成水，以水蒸气逸出检测器，若温度低，水冷凝在离子化室会造成漏电并使色谱基线不稳，故检测温度应高于100℃。2.5.2TCD操作条件2.5.2.1 检测器温度和载气流速的波动影响稳定性，故必须稳定。检测器温度一般设定与柱温相同或高于柱温。2.5.2.2因热导检测是基于参比池气路中流过的纯载气与样品池气路中有被测组分流过时导热系数的差别而测定，故选用与被测成份蒸气导热系数相差大的气体作为载气灵敏度高。用作有机物、水分测定时，理想的惰性载气氦。若不须高灵敏度时，也可采用氮。氢的导热系数大，也可作分析某些品种的载气，但须注意通风。2.5.3ECD操作条件2.5.3.1ECD的放射源多用63Ni，可在450℃以下工作，有些ECD用氚为放射源的，检测器温度不得超过200℃。2.5.3.2ECD对电负性成分灵敏度高，故要求载气纯度高，至少要在99.99%以上，检测器的温度对响应值也有较大影响。2.6色谱柱色谱分析好坏主要决定用色谱柱，气相色谱柱分为填充柱和毛细管柱两大类。2.6.1填充柱2.6.1.1柱材、柱长与柱径常用有不锈钢柱和玻璃柱，不锈钢柱主要优点是坚固、耐用，但不适用于不稳定的化合物，玻璃柱无以上缺点，但易破碎。柱长常用1～3m，以2m为最常用。柱径一般为2～4mm，细径柱的柱效比粗径柱高2.6.2填料色谱柱内填料分为三大类：吸附剂类、多孔性高分子微球和涂布固定液的硅藻土类载体，吸附剂常用于气体。2.6.2.1 多孔性高分子微球，它是以苯环为主链的交联高分子，常用苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，采用不同的制备条件和原料，可合成具有不同极性微球。商品不同型号的微球，适用于不同极性的化合物。微球具有交联结构，机械强度好，填充过程不会破碎，有很宽的温度使用范围（78～240℃），可用于分析永久性气体或短链极性化合物，醇、酸和胺类等，水在这类柱上分离出对称的峰。微球可直接装填，但因微球带有静电，装填不易，为此可用丙酮润湿过的纱布擦填充漏斗，以消除静电，使填充顺利进行。2.6.2.2硅藻土类载体，分为红色和白色载体两种。2.6.2.2.1红色载体是将天然硅藻土粉碎，并压成砖形，在900℃以上煅烧，由于生成氧化铁而产生红色。红色载体表面积大（4m3/g），孔穴密集，孔径小（1μm），结构紧密，机械强度好，但它表面活性中心较多，吸附性较大，适用于非极性固定液，使用于分析非极性或弱极性物质，若分析极性物质时会有色谱峰拖尾现象。2.6.2.2白色载体在天然硅藻土中加入小量碳酸钠助熔剂，在900℃高温锻烧后，氧化铁变成了无色的硅酸钠铁络合物，使原来浅灰色的天然硅藻土变成白色。白色载体的表面积小（1m2/g），孔径粗（9μm），结构疏松，机械强度不如红色载体。但它表面活性中心显著减少，吸附性小，适用于极性固定液，可用于分析极性或氢键型化合物。2.6.3固定液对固定液的要求：在操作范围内蒸气压低，热稳定性好，样品各组分在其中应有足够溶解能力，选择性高，即对两个沸点相同或相近但属于不同类型的化合物有尽可能高的分离能力。固定液的选择取决于样品的组成。一般按“相似相溶”的原则，即组分的结构、性质与固定液相似时，在固定液中溶解度大，因而保留时间长；反之，溶解度小，保留时间短。2.7毛细管柱（空心柱）毛细管柱具有分离效能高，分析速度快，样品用量少等特点。2.7.1最常用FSOT柱固定相。2.7.2FSOT柱的选择FSOT柱的选择应考虑以下因素： 2.7.2.1固定相在进行样品分析时，首先选用非极性固定相，因为这种柱性能好，如柱效高、对氧不敏感、最高使用温度高、柱寿命较长等特点。必要时应选用极性较高的固定相，以增加组分与固定液的相互作用，达到较好的分离。2.7.2.2柱内径与固定相液膜厚度内径0.25mm膜厚0.25μm的柱是常用柱，兼顾了柱效和样品容量。为了增加样品容量。可选择内径较大、液膜较厚的柱，如0.35mmid、50μm的柱。但是增加样品容量是在牺牲柱效的条件下获得的。为了提高柱效，可选用细内径、薄液膜柱如0.53mmid的柱，液膜厚度1～5μm，则在一定程度上可代替填充柱，且具有较高的柱效，对仪器及操作者的要求较低，定量分析的再现性也提高。2.7.2.3柱长商品柱一般有12m、25m、50m三种，一般常采用25m长柱，复杂样品需用较长的柱。如样品中组分不多、性质不同，则用短柱比较有利，这包括分析速度快，固定相流失少，费用少等。2.7.2.4柱的老化、维护与贮存 与填充柱一样，新柱需要老化，以除去残留溶剂及低分子量的聚合物。此外，老的柱也应定期老化，尤其是出现基线漂移，某些色谱峰开始拖尾时，以除去样品中的难挥发物在柱头的积累。要用高纯度的载气，以免缩短柱寿命，如聚乙二醇固定相柱最易被氧化、毛细管柱的前端数厘米处易损坏，如不挥发物的积累，进样溶剂的侵蚀及机械损伤等。可以切除这受损害的几厘米处，不至于影响总的柱效。切除时切口应平整。如果是横向交联或键合相柱，则可用适当的溶剂洗涤除去污染物，以使柱再生。选择何种溶剂取决于污染的性质、程度和固定相的种类。一般用戊烷来洗涤。如污染物物极性较大，可用二氯甲烷或甲醇。但横向交联的聚乙二醇－20M，应避免用极性溶剂和二氯甲烷洗涤。洗涤FSOT柱，一般用2ml溶剂已足够。选用一装置，加压以使溶剂自出口端向入口端缓缓通过色谱柱。洗涤后，先在低温下除去溶剂，再进行老化处理。毛细管色谱柱如不使用，应小心贮存，可用硅橡胶块将两端封闭，置于盒中。色谱数据采集处理系统，由于微电子技术的不断发展，特别是微处理机的出现，因此气相色谱仪可以利用微处理机完成数据采集和处理，也可以对色谱仪的进样器，柱温、检测器、温度程序等参数进行控制，使色谱分析自动化成为可能，因商品规格型号不同，具体操作也不一样，可根据仪器说明书进行操作。3．开机操作3.1检查仪器上电器开关，均处于“关”位置。3.2选好合用的色谱柱，柱两端应堵有盲堵。3.3取下盲堵，分清入口端及出口端，装于仪器上，拧紧固定螺母，但也勿过紧，以不漏气为度。若有换下色谱柱，应堵上盲堵保存。3.4开启载气钢瓶上总阀调节减压阀至规定压力。3.5用表面活性剂溶液检查柱联接处是否漏气，如有漏气应检查刃环或再略加紧固螺母。3.6如果仪器有恒压和恒流阀调节气流量，换柱后可不再调节，若有疑点应用皂膜流量计检查和调节流量。3.7打开各部分电路开关，设定气化器、柱箱和检测器温度。开始加热。 3.8待各部分温度恒定后，开氢钢瓶总阀、空气压缩机总阀，同载气操作。3.9按下点火按钮，应有“卟”的点火声，用玻璃片置火焰离子化检测器气体出口处，检视玻璃片上应有水雾，表示已点着火，同时记录器应有响应。3.10调节仪器的放大器灵敏度等，走基线，待基线稳定度达到可以接受范围内，即可进样分析。气相色谱法测定样品溶液时，多用微量注射器进样。采用手工进样时，精密度决定于操作熟练程度，各步操作应尽量一致。为了消除注射器针头进入进样器期间因溶液受热膨胀造成进样体积不准确的因素，可试用以下进样方法：3.10.1将微量注射器用配制样品的溶剂充分冲洗。3.10.2轻轻推入活塞至完全进入针筒，使针头内充满溶剂。3.10.3在空气中小心抽出活塞至一定刻度，例如5～10μl的注射器可将活塞端抽至1.0μl刻度处。3.10.4将注射器针头插入样品溶液中，慢慢抽取数μl样品溶液，可以看到针筒内靠近活塞端有一段溶剂（其体积为针头内的体积），中间有一段空气，靠近针头一段为样品溶液。3.10.5取出注射器，慢慢推出样品溶液，使活塞端至所需进样体积加抽取空气体积处，例如按3.10.3项在1.0μl，欲进样1.0μl，则推至2.0μl刻度处。3.10.6用滤纸擦净针头外部。3.10.7再次小心抽出活塞，使空气进入针筒，并使样品溶液—空气界面准确至一整数刻度处，便于读取样品溶液体积，例如至1.0μl，此时可以看到针筒内自针头处至活塞端共有四段：（1）空气（1.0μl处）；（2）样品溶液（1.0～2.0μl ）；（3）空气（2.0～3.0μl）；（4）溶剂（其体积为针头内体积）。3.10.8核对样品溶液体积。3.10.9将注射器针头全部插入进样器。3.10.10注入样品，并拔出针头，即完成进样。3.11分析完毕，待各组分均流出后，可关断各加热电源开关，同时关氢，空气，待检测器及柱箱降温至约150℃以下，关载气3.12使用登记。如工作完毕欲取下色谱柱，取下后应将柱两端用盲堵堵上。3.13如果是做溶剂残留量试验，应取出气化器内玻璃或石英插管，清洗干净再放入。4．样品的测定4.1仪器系统适用性试验应符合药典或部颁标准各品种项下的要求。4.2供试品及对照品的配制精密称取供试品和对照品各2份，按各该品种项下的规定方法，准确配制供试品溶液和对照品溶液，按规定精密加入内标液或用外标法测定。4.3预试验初次测定该品种时，可先经预试验以确定仪器参数，根据预试验情况，可适当调节柱温，载气流速，进样量等，使色谱峰的保留时间、分离度、峰面积或峰高的测量能符合要求。如用积分仪作峰面积应不得少于10，000μV·s。否则应调节进样量，也可调节FID的灵敏度，但应注意信噪比是否达到。4.4正式测定正式测定时，每份校正因子测定溶液（或对照品溶液）及供试品溶液各进样2次，2份共4个校正因子及4个供试品数据结果平均值相对标准差（RSD）不得大 于1.5%。用外标法测定同上相对标准差不得大于2.5%。如超过应重新测定。多份供试品测定时，每隔5批应再进对照品2次，核对一下仪器有无改变。5．原始记录气相色谱分析的原始记录，除按一般药品检验记录的要求记录外，应注明仪器型号，色谱柱号，气化室、色谱柱箱、检测器的温度，载气流量，放大器灵敏度及衰减，进样体积，并附色谱图及处理打印结果。6．填充色谱柱的填充及其它维护6.1柱清洗不锈钢新柱先用温热5%～10%氢氧化钠液浸泡，先后用水、乙醇、丙酮清洗，烘干。玻璃柱用稀硝酸（5%～10%）浸泡，再用水、乙醇清洗，烘干。为了减少拖尾现象，可作硅烷化处理：方法是用5%二氯二甲基硅烷（DMCS）的甲苯溶液浸泡5～10分钟，倾出后，用甲苯冲洗1次，再用甲醇冲洗，然后再烘干。处理了的空柱子如不立即使用，两端应用套子套好。6.2填料颗粒大小的选择选用颗粒直径有0.25～0.18mm（60～80目）；0.18～0.15mm（80～100目）；0.15～0.125mm（100～120目）3种，要求粒度均匀，在20目以内，填装后颗粒孔隙一致，减少涡流扩散。一般2～4mm直径柱，2～3m柱长，使用0.25～0.18粒度比较适合，柱前压低。如果使用于难分离物质对时，可用0.18～0.15mm，使柱长不超过2m以上。0.15～0.125mm粒度，最好用于1.5m长度以下的色谱柱。6.3固定液的涂布6.3.1固定液涂布量白色载体用作分析柱的涂布量一般可选10%。6.3.2蒸发法先将一定量的固定液溶解于一定体积的溶剂中，加入一定量的过筛的载体，注意载体加入后能被溶剂全部浸没，轻轻搅动后，移入蒸发皿中，在通风厨中使溶剂 挥发，在挥发同时不断轻轻搅拌载体，直至溶剂挥发后，再移入红外灯下使溶剂挥发干燥，移入烘箱中100～120℃烘2小时。如果涂布硅酮类固定液，如SE－30在室温溶剂中溶解完全需16小时以上，应使用回流加热法，即将溶解在适宜溶剂的固定液，置于回流瓶中（磨口）在水浴上加热回流1小时，使固定液溶解完全，放冷，加入一定量载体，再加热回流2小时，将载体和溶剂移入蒸发皿中，以下操作同上述方法。此种蒸发法固定液在溶剂蒸发时有爬逸现象，造成涂布不匀，可于蒸发时用旋转蒸发器，但这样容易使载体破碎，故应多涂布一些，烤干后再过筛一次。6.3.3过滤法其主要优点是固定相涂布均匀，这对低浓度的固定相尤为重要，另处也很少发生载体破损现象，但是难于得到再现的、精确的固定相含量。即准确称取一定量的固定液，溶于溶剂中，使成一定浓度的固定液，用本法涂布固定液时，配制的固定液的浓度与预期载体上固定液含量（重量比）相同。如用白色硅藻土载体，固定液溶液浓度约为预期的载体上固定液含量之半。因为红色载体每克吸收溶液1ml，一般白色担体吸收溶液约2ml。操作方法：先将配制好的溶液置于抽滤瓶中，溶液用量约为载体重量的4倍，称取一定量的载体（通常为25g左右），分散于固定液溶液中，缓缓减压抽空后，再旋动抽滤几分钟以便释出载体中的空气，使溶液渗入到载体颗粒中，然后放气。轻轻地旋动抽滤瓶，将担体悬浮起来，迅速一次倾入布氏漏斗中，使形成光滑平整的载体层，抽滤时，真空度应保持尽可能低，待抽滤到开始出现滴状时，立即停止抽滤，把载体转移到蒸发皿中，铺平，自然挥发干燥，然后在100℃烘干。如果得知担体上涂布固定的含量，可由蒸发滤液称取残渣重量或取制好的载体用索氏提取器提取测定液重量。6.3.4柱的填充 在柱出口处塞上小团玻璃棉，用一个绸布包住出口处，接上真空泵，把填料小量分次装入柱中，一边装一边震动（可用旋涡震荡器）或轻轻敲打柱子各部位，使填炒在柱内尽量填充均匀、紧密，待填料装满柱子后，把玻璃棉塞上入口处。填充时注意：柱要填充得紧密均匀，尽可能无死空间，敲打不能过猛，以免担体破碎，并注意抽气的一端与检测器相接，而另一端接至汽化室。6.3.5柱的老化填充好的柱应进行老化处理才能使用，老化的目的是除去填充物中残留挥发性成分，并使固定液再一次均匀牢固地分布在担体表面上，久未使用的色谱柱在重新使用前亦需再作老化处理，一般处理方法是将柱装入色谱仪中使载气缓缓通过色谱柱，然后在高于正常温度20～50℃、而不超过固定液最高使用温度时加热24小时，为了避免柱污染检测器，在老化过程中不要将柱出口与检测器相接，让其放空，如有条件，可以用程序升温方法老化柱，效果更好（以每2～5℃/分钟的速率把温度升高到老化温度保持12～24小时）。有些硅酮类的固定液如SE－30，可用一种特殊的顺序增强惰性及柱效，即250℃保持柱温1小时，同时通氮除去氧和溶剂，停止通氮，加热至340℃，维持4小时，然后降温至250℃，通氮老化直至基线稳定，如测定易分解的生物碱硫酸阿托品含量时，色谱柱必须经这样处理减少活性，否则产生色谱峰拖尾和组分分解。6.3.6检测器清洗FID检测器往往由于固定液流失，样品在喷嘴燃烧后产生积碳，或使用硅烷化衍生试剂沉积二氧化硅，污染检测器，喷嘴内径变小，点火困难，检测器性范围变窄，收集极表面也沉积二氧化硅，使灵敏度下降，故最好卸下喷嘴和收集极清洗，先用通针通喷嘴，必要时用金相砂纸打磨，然后再依次用洗涤剂、水超声清洗。在100～120℃烘干。收集极也按上述方法清洗.