国立东华大学化学研究所

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國立東華大學化學研究所碩士論文指導教授：蘇宏基博士序列注入線上微波水解免疫質譜法分析尿液中之嗎啡與morphine-3-glucuronideOn-linemicrowavehydrolysisandimmunoaffinityelectrospraymassspectrometryusingsequentialinjectionanalysissystemformorphineandmorphine-3-glucuronide研究生：周靜怡中華民國九十一年七月五日\n摘要本研究主要是利用自動化序列注入系統進行線上微波水解並連接免疫親和質譜法分析尿液中之嗎啡，來取代傳統酵素或酸水解的前處理方式。此系統之設計分為兩方面，包含有封閉式與開放式之微波水解系統，且均具有自動化與節省時間之優點。另外透過此單株抗體對M3G也具親和性之特性，發展多重分析(multiresiduesanalysis)，其分析之對象為嗎啡與其代謝物Morphine-3-glucuronide（M3G）與Morphine-6-glucurronide（M6G）。封閉式之微波水解系統在微波加熱時間6秒及650W之微波功率下，M3G之水解率可達92%，嗎啡之線性範圍為100至4000ppb。在開放式之微波水解系統方面，則是在微波時間80秒及230W之微波功率下，M3G之水解率可達到95%，其嗎啡之線性範圍為200至4000ppb。至於偵測陽性煙毒犯之尿液與法定之慈濟檢測中心GC-MS之結果相比對均具有一致性。同步分析嗎啡、M3G與M6G方面，由於可省略微波水解之步驟，因此可將總分析時間縮短為12分鐘內，嗎啡之線性範圍為50至2000ppb，M3G與M6G則為300至2000ppb。嗎啡與M3G如使用Morphine-D6與M3G-D3為內標準品，不會造成互相干擾，亦不受到6-acetylmorphine與codeine之影響，因此可成功的同步分析Morphine、M3G與M6G。至於偵測陽性煙毒犯之尿液與法定之慈濟檢測中心GC-MS之結果相比對具有一致性。I\nAbstractAnon–linemicrowavehydrolysisandimmunoaffinityelectrospraymassspectrometryusingsequentialinjectionanalysis（SIA）wasdevelopedfortheanalysisofmorphineandmorphine-glucuronidesinurine.Theurinesamplespretreatedbyoff-lineenzymeoracidhydrolysistoproducethemorphinefromitsglucuronidederivateswereherereplacedbymicrowaveassistanthydrolysisusingSIA.Thehydrolysisefficiencyofmorphine-3-glucuronide（M3G）inclosedandopenedmicrowavehydrolysissystemis92%for6sand95%for80srespectively.Thedetectionlimitofmorphineinurinewas100ppb（6s）and200ppb（80s）.Thelinearityfrom100to4000ppband200to4000ppbwereobserved,respectively.Themorphine-6-glucuronidecanbeefficientlyhydrolyzedusingthismethod.Furthermore,asystemtoanalysismorphineanditsglucuronidessimultaneouslywasdeveloped.TheaimedwastodeterminemorphineanditsglucuronidesderivatesbyimmunoaffinityinSIAandanalyzedbymassspectrometry.Thus,thehydrolysispretreatmentcanbeomitted.Thedetectionlimitsare50ppbformorphineand300ppbforM3GandM6G,respectively.Linearitywasobservedintheconcentrationrange50to2000ppb（morphine）and300to2000ppb（M3GandM6G）Thehigherthroughputandautomationcanbeachievedbythesesystems.TherealurinesamplesfromabusedpatientswerestudiedandcomparedwiththeGC-MSmethod.II\n目錄第一章緒論........................................................................................1一、嗎啡的介紹.................................................................................1（一）嗎啡偵測的重要性...........................................................1（二）嗎啡的前處理...................................................................1（三）嗎啡的偵測方法...............................................................1二、以水解法處理生物樣品.............................................................3（一）尿中嗎啡尿苷酸化合物之酸水解與酵素水解之比較...3（二）尿中其他藥物複合物的水解...........................................3（三）非傳統藥毒物分析之檢測樣品水解...............................4三、微波水解......................................................................................5（一）微波加熱的原理與應用...................................................5（二）批次（batch）微波加熱系統...........................................6（三）Flowinjectionanalysis（FIA）微波加熱系統................6（四）Sequentialinjectionanalysis（SIA）微波加熱系統.......7四、免疫固相萃取.............................................................................8（一）抗體的簡介.......................................................................8（二）免疫固相萃取的簡介.......................................................8（三）免疫固相萃取的應用.......................................................9五、電灑質譜術.................................................................................10（一）電灑離子化原理...............................................................10（二）電灑離子形成機制...........................................................10第二章、材料與方法.........................................................................11一、實驗用藥品.................................................................................11二、實驗儀器與器材.........................................................................12III\n三、實驗步驟......................................................................................13（一）抗體固定化方法...............................................................13（二）系統控制timeprogram.....................................................141、封閉式微波水解SIA-MS系統控制timeprogram.............142、開放式微波水解SIA-MS系統控制timeprogram.............153、同步分析嗎啡、M3G與M6G之ESI-MS系統................16第三章、結果與討論.........................................................................17一、電灑質譜法之條件選擇.............................................................17二、SIA系統條件之選擇..................................................................18（一）封閉式微波水解系統.......................................................18（二）開放式微波水解系統.......................................................19（三）同步分析嗎啡、M3G與M6G之ESI-MS系統............20三、抗體之選擇性的測試.................................................................21（一）抗體（8.31mg/gCPG）對嗎啡之捕捉能力測試..........21（二）抗體（16.4mg/gCPG）對嗎啡與M3G之捕捉能力....21四、嗎啡、M3G與M6G之檢量線.................................................21（一）封閉式微波水解系統之嗎啡檢量線...............................21（二）開放式微波水解系統之嗎啡檢量線...............................22（三）同步分析嗎啡、M3G與M6G之檢量線.......................22五、同步分析Morphine與M3G之回收率.....................................23六、6-Acetylmorphine與codeine對分析嗎啡與M3G的干擾......23七、真實尿液樣品分析.....................................................................23八、線上封閉式與開放式微波水解系統與非線上GC-MS比較..24第四章、結論與展望.........................................................................25第五章、參考文獻.............................................................................26IV\n表目錄表1-1嗎啡尿苷酸化合物之酸性水解與酵素水解之比較...........30表1-2微波前處理在FIA與SIA的應用......................................31表2-1SIA-Hydrolysis(封閉式)-ESI-MS系統控制timeprogram.32表2-2SIA-Hydrolysis(開放式)-ESI-MS系統控制timeprogram.33表2-3同步分析嗎啡、M3G與M6G之系統控制timeprogram34表3-1嗎啡與Glucuronides之電灑質譜法條件選擇...................35表3-2封閉式微波水解系統之嗎啡檢量線...................................36表3-3同步分析morphine、M3G與M6G在ESI-MS與SIA-ESI-MS之檢量線比較...............................................................36表3-4同步分析Morphine與M3G之recovery............................37表3-56-Acetylmorphine對Morphine與M3G定量的影響........37表3-6codeine對Morphine與M3G定量的影響.........................37表3-7封閉式微波水解系統之真實尿液樣品分析.......................38表3-8開放式微波水解系統之真實尿液樣品分析.......................38表3-9同步分析Morphine、M3G與M6G之真實尿液樣品......39表3-10線上封閉式與開放式微波水解系統與非線上GC-MS的比較...................................................................................40V\n圖目錄圖1-1鴉片類藥物代謝圖...............................................................41圖1-2序列注入系統結構圖...........................................................42圖1-3免疫球蛋白（IgG）簡化的分子結構圖.............................43圖1-4生物辨識元的固定方法.......................................................44圖1-5免疫親和樣品分離流程圖...................................................45圖1-6ESI-MS儀器裝置圖.............................................................46圖2-1SIA-Hydrolysis-ESI（封閉式）裝置圖..............................47圖2-2SIA-Hydrolysis-ESI（開放式）裝置圖..............................48圖2-3SIA-ESI儀器構造圖............................................................49圖3-1溶於formicacidpH2.1中之1ppm嗎啡質譜圖...............50圖3-2溶於formicacidpH2.1中之1ppm嗎啡質譜圖...............51圖3-3溶於formicacidpH2.1中之1ppmM3G質譜圖..............52圖3-4溶於formicacidpH2.1中之1ppmM6G質譜圖..............53圖3-5封閉式微波水解統之微波功率對M3G水解率的影響....54圖3-6封閉式微波水解系統對溶於水中M3G水解率的測定....55圖3-7開放式微波水解系統之微波時間對M3G水解率的影響56圖3-8開放式微波水解系統對M3G之水解率穩定度的測定....57圖3-9抗體(8.31mg/gCPG)對溶於水中嗎啡之捕捉能力測試...58圖3-10抗體(16.4mg/gCPG)對溶於水中嗎啡之捕捉能力測試...59圖3-11抗體(16.4mg/gCPG)對溶於水中M3G之捕捉能力.......60圖3-12開放式微波水解系統對溶於尿液中嗎啡之檢量線...........61VI\n第一章、緒論一、嗎啡的介紹（一）嗎啡偵測的重要性嗎啡(morphine,MO)是鴉片中最主要的生物鹼成份，外觀為白色粉末或白色針狀結晶，其主要作用為中樞神經之抑制劑，是癌症末期患者最常用之止痛劑。由於它也是海洛因及可待因的代謝物，其代謝途徑如圖1-1所示，因此在海洛因與可待因濫用嚴重的今天，嗎啡的定量便顯得相當的重要。（二）嗎啡的前處理由於嗎啡是親脂性的化合物，在人體內與尿苷酸(glucuronicacid)進行共軛反應，形成親水性morphine-3-glucuronide(M3G)與morphine-6-glucuronide(M6G)，之後再經由腎臟排除，負責催化此反應之酵素為尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉移[uridinediphosphate(UDP)glucuronyltransferase]，而尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDPGA,uridine-5’-diphospho-α-D-glucuronicacid)為其輔酶。在人體的尿液中約有80%-95%的嗎(1)啡會以此種共軛形式存在，其中M3G最多，M6G居次。再加上鴉片類藥物其本身毒性極強，因此存在人體內嗎啡的劑量較低，造成嗎啡在定量上較困難。因此在嗎啡分析前需先將Morphine-glucuronide切斷成為morphine，否則將有超過90%可待因及93%的嗎啡會漏失，酸水解(acidhydrolysis)與酵素水解(enzymehydrolysis)為常用的去(2)除glucuronidegroup的前處理方式。1\n（三）嗎啡的偵測方法許多方法都可以用來偵測嗎啡與其代謝物，但唯有HPLC可同時分離這些親脂性與親水性的化合物。偵測方法的選擇包含有(4-9)(10)ultravioletspectrometry、amperometry、coulomrtry、fluorimetry(11-13)等，但都無法達到較好的靈敏度。使用GC-MS雖然有較高的選擇性與靈敏度，但偵測前需進行衍生化，使得整個分析方法較為複雜、耗費時間與昂貴。在LC-MS方面，使用大氣壓力離子化介面(atmosphericpressureionizationinterface)，由於樣品直接由大氣壓力下進入真空狀態中，因此可達到如GC-MS一般的靈敏度，非常適合應(14-17)用在嗎啡的偵測。2\n二、以水解法處理生物樣品（一）尿中嗎啡尿苷酸化合物之酸水解與酵素水解之比較表1-1比較了兩種方法在水解尿中嗎啡尿苷酸化合物時所採用的(40)各種條件及產率。在1978年時Predmore等人證實在酸水解方面，以autoclave與steamcone的方式進行效果最佳，在混有8~15%鹽酸。的嗎啡尿苷酸化合物在加熱125C及30分鐘後，可獲得93%產率的嗎啡，其速率受到溫度、壓力與鹽酸濃度的影響，若是在沸水浴中。進行2小時，其產率只有66%。在酵素水解方面，若在37C的反應(2)溫度下進行，要達到80%的水解率，需加熱40小時的時間，而之後有研究顯示該現象的發生需視酵素來源而定。在1982年時Combie等人發覺，使用由Patellavulgata分離出的熱穩定酵素，可提高溫度。至65C，其他如得自Helixpomatia(H-1型)及Helixaspersa(HA-4型)。的β-glucuronidase一直到55C亦都算穩定而有效，顯著地改善了酵(3)素水解的速度，當然如果可能的話，培育溫度愈高愈好，因為每增。高10C，反應速率會增快1倍，故Patellavulgata應屬最佳選擇。在1993年時Jennison將上述的兩種最佳方式做比較，顯示酸水解以90%。以上的水解率只需20分鐘遠優於酵素水解的2小時，而100C以上(1)的水解溫度與121psi的壓力成為酸水解的最佳條件。因此，傳統上嗎啡尿苷酸化合物以酸水解之前處理方式較酵素水解更廣為人所使（45-54）用。（二）尿中其他藥物複合物的水解除了嗎啡，尚有多種其他的麻醉藥複合物，為了易於偵測可予以(38-40)水解，包含有：Etorphine、Buprenorphine、acetylmorphine、Hydromorphone、Hydrocodone、naltrexone及6-β-Naltrexol，另外亦應用在許多benzodiazepine(抗焦慮劑之一類)的分析工作上，其他還3\n有methaqualone(一種非巴比妥類之鎮定安眠藥，國內俗稱『白板』)、ketamine(一種全身性麻醉劑)、stanozolol(一種同化類固醇)、acetaminophen(一種非成癮性止痛抗炎藥)及diphenhydramine(一種抗組織胺-抗神經激胺製劑)。（三）毛髮等非傳統性藥毒物分析之檢測樣品水解生物組織諸如血液及尿液是常被用來分析藥毒物的鑑識樣品，一般而言，這些樣品有一個缺點，只能在採樣前3-5天使用藥毒物者，才會被檢測出來。近來，非傳統檢測樣品(如毛髮)因有可保留藥毒(40-44)物較長時間(數月至數年)而倍受重視。同時，樣品易於取得及藥毒物在樣品內之穩定性亦佳，目前已可成為血液及尿液樣品之互補性樣品。而從毛髮中釋出分析物通常需經由培育或消化步驟，常使用的方式便為酸、鹼或酵素水解。4\n三、微波水解（一）微波加熱的原理與應用微波是一種以電磁波形式存在的能量，頻率範圍約由300至300,000MHz之間，最常使用的頻率為2450MHz，它可以引發溶液中離子的遷移與偶極矩的轉動，其轉動的現象是當微波場作用時，極性分子的偶極矩會依其極性做規則性的排列，當微波場消失時，分子則會趨向最大亂度的排列。但不論是離子遷移或偶極轉動都會與鄰近分子互相發生碰撞而產生熱能，致使液體溫度亦隨之升高。而溫度上升速率與被加熱物質的散逸係數(δ)有關，散逸係數的定義為介電損失因數與介電常數的比值(Tangentδ=ε’’/ε’)，當一個物質的介電損失因數越大，意即其散逸係數越大時，則該物質吸收微波能量的速率會越(18-19)快。微波加熱在近十年是一項重要的樣品前處理技術，與一般傳統加熱法最大的不同處在於能量的傳遞方式，傳統加熱法的能量是利用傳導的方式經容器傳遞到溶液中，再藉由對流的作用讓熱均勻分布，使溶液溫度升高，而微波加熱法之微波能是以輻射的方式傳遞，故直接對溶液進行加熱，無須經由容器傳遞熱能，此種作用方式可提高加熱的速率，降低熱能傳遞過程中的能量散失，並且使加熱更均勻。因此它可成功地被運用在化學反應、環境保護、萃取、消化與水解技術上，並且有：節省能源、時間、減少操作程序、減少有機溶劑使用，可降低所產生廢棄物對環境之負荷等優點，是一項符合永續發展觀念的科(18)技。5\n（二）批次（batch）的微波加熱系統微波加熱裝置已有專為一些微波消化、萃取與化學合成反應所設計之商業化產品，但卻難免會受到瓶子數的限制，而只能進行例行性的批次分析。在嗎啡的鑑定上，使用自動化線上分析技術，才能符合快速分析的需求，而FIA與SIA的分析技術正好符合這方面的需求。（三）Flowinjectionanalysis(FIA)的微波加熱系統FIA首先由Ruzicka與Hansen在1975年所提出的，其目的是為了解決實驗室中大量之例行性定量分析工作。其原理是利用一個連續的流體作為載液，連續不斷在管線中流動，再藉由注入閥將樣品注入該流體中，形成帶狀擴散(Dispersion)以進行反應，並傳送至偵測器中偵測，由於FIA仍有試劑消耗量過大與進行複雜反應時，所需的管路數量過多，造成系統過於繁複，而有不易操作與維護的缺點，使得(20-21)FIA系統在實際推廣應用上受到限制。FIA與微波前處理系統結合大都應用在樣品的消化與萃取反應上，僅有極少部分應用在水解反應，其水解反應實例如表1-2所示，由於均使用光學偵測器偵測，因此最大的缺點在於微波加熱時氣泡的產生與高溫的液體會干擾偵測的訊號，因此需額外的去氣與冷卻裝置，造成了時間的浪費與系統的複雜性。另外持續不斷的流動方式會造成試劑的浪費，若要延長微波加熱的時間，則必須增長微波爐內管(22-25)路的長度，易造成樣品稀釋較嚴重，使得偵測極限升高的問題。6\n（四）Sequentialinjectionanalysis(SIA)的微波加熱系統SIA是在1990年時由Ruzicka與Marshall所發表的，其架構非常簡單，如圖1-2所示，以多向旋轉閥連接樣品與試劑，利用pump依序吸取至holdingcoil中，如此便可降低試劑的消耗量；再透過相鄰試劑間的擴散達到反應的效果，若遇到反應速率較慢時，可停止流動讓反應更完全。因此它最主要的優點在於系統的設計富有彈性，且均由電腦控制，重複性佳，準確度高，可適用於各種複雜的化學反應。並且可做多種形式的偵測，包含有持續流動偵測與kinetic的偵測(20)(26)，在近年來更將Lab-on-valve的觀念運用在SIA的設計上，讓系(27-28)統更微小化，使其在實際推廣應用上較FIA為廣泛。SIA主要的應用範圍有：偵測發酵過程中的葡萄糖，總生物質量與游離氨及環境分析(廢水分析)、放射性物質與藥理方面的偵測。近年來也有利用beadinjection的模式自動化更新管柱內固相物質等應用。SIA與微波系統結合的實例並不多，如表1-2所示，目前只應用在消化反應上。由於SIA系統的多變性，因而可簡化在消除微波加熱時所生成的氣泡與高溫所需的步驟，stop-flow的設計則使得微波加熱(29-31)反應更完全。7\n四、免疫固相萃取（一）抗體的簡介抗體又稱免疫球蛋白，是一種糖蛋白，如圖1-3所示，由輕鏈(Lightchain,L)以及重鏈(Heavychain,H)peptide組成，所謂”輕”鏈以及”重”鏈是指它們的分子量而言。最簡單的抗體是呈Y字型，在L以及H上可分為變異區以及恆定區兩個部分，變異區負責和抗原結合，而恆定區則和一些生物功能有關，例如補體活化以及和細胞接受器結合等。在L以及H鏈上都有三個變異相當大的區域，每個變異區內只有5-10個胺基酸可形成抗原結合區，而抗體之特異性便是由這些變異區所決定。抗體-抗原的結合則主要和靜電力、凡得瓦力與氫鍵有關。（二）免疫固相萃取的簡介儘管高靈敏度的分析儀器不斷的在發展，但對於環境與生物樣品的分析而言，快速與有效的前處理過程仍是必須的。傳統的液相-液相萃取（LLE），由於溶劑使用量過多，已逐漸沒落，取而代之的是固相萃取（SPE），如今已成為最被廣泛使用的一種前處理方式，其另一項優點為自動化的可行性較高，其再現性通常優於手操作法，最早自動化固相萃取的應用出現在1982年，緊接著商業化的產品亦被（40）發展出來，目前已廣為採用作為藥物之檢測。但SPE最大的問題在於當樣品濃度過低且基質干擾嚴重時，需額外的clean-up步驟，而增加前處理的步驟，只怕會有回收率降低、污染物增加與重複性降低等風險，因此才發展出將抗體以共價鍵的方式固定在適合的固相上，利用antigen-antibodyinteractions具有良好之專一性的原理來改善(32-33)SPE的選擇性。8\n（三）免疫固相萃取的應用免疫固相萃取的應用已相當多，其常使用的固定化方法為：共價鍵結、陷入法、吸附法、膜包覆法與交聯法，如圖1-4所示。其主要的流程為：活化固相萃取管柱、裝填樣品、沖洗與沖提，如圖1-5所示。應用範圍包含有天然食物之內含物、藥物及各種有機的污染物。並且可透過抗體的cross-reactivity來發展多重分析(multiresiduesanalysis)，萃取特定之化合物與其代謝物或其它相似物。免疫固相萃取通常與LC做結合，若以非線上的型式進行，在偵測小分子時，由於常使用大量低pH值的脫附劑，造成需做進一步脫附劑揮發的缺點，因此以線上結合LC的方式是較受到歡迎的，但固相方面則需選(33)擇能抗高壓的材質較佳，如silica等。在嗎啡的應用上，目前只有非線上的形式，因此在樣品萃取後需伴隨揮發與乾燥的步驟。另外在萃取時要有良好的特異性是相當困難的，其干擾物如：M3G、M6G、normorphine、norcodeine、codeine等會影響嗎啡定量，故往往需加入(34-36)內標準品以改善其分析的準確度。9\n五、電灑質譜術電灑游離法是將分析物在大氣壓下，直接由溶液中汽化與游離，其游離方式較為軟性，主要的離子化過程可分為四個步驟：產生帶電荷液滴、溶劑揮發使液滴收縮和分裂、產生氣態離子，之後由大氣壓力下傳送至真空狀態之質譜分析器偵測，本研究所使用之質譜儀儀器構造圖如1-6所示。（一）電灑離子化原理當液體流往毛細管針端時，若針端施予正電壓，則正離子會往液體表面移動，負離子則遠離液面，此過程稱為電泳機制(electrophoreticmechanism)，而這種表面正電荷的聚集會造成液面的不穩定，於是會拉長而形成一個圓錐狀，稱之為泰勒錐（Taylorcone）。此時若施予更高的電壓在針端上，則針端液面的靜電斥力便能克服液面的表面張力，於是圓錐狀的液體便開始分裂出帶電荷的液滴，之後再進入蒸發室使溶劑揮發，並且將不帶電荷之樣品擋住，只容許離子或被溶劑包(37,55)圍的樣品離子(solvatedion)得以通過，再進入偵測器進行偵測。（二）電灑離子形成機制離子化的程序會影響定量的結果，因此了解離子化的過程是非常重要的，雖然ESI的應用已被證實，但離子形成的機制仍然不是完全了解，目前存在有兩種說法。(1)chargeresiduemodel(CRM，電荷餘留模式)(Dole)由於電荷液滴在傳送過程，因溶劑揮發後，電荷仍留在分子上，使得液滴表面庫倫斥力增加，造成液滴分裂成更小的液滴，直至最後(37,55)一個液滴擁有一個離子為止。(2)iondesorptionmodel(IDE，電荷脫附模式)(IribarneandThemson)溶劑揮發造成離子濃縮，使得庫倫斥力強於analytesolvation(37,55)energy，離子便從液滴表面揮發，為的是去降低系統的能量。10\n第二章、材料與方法一、實驗用藥品（一）抗體Monclonalantibodyoftheanti-morphinefrommice3.81mg/mL:TaiwanAdvanceBio-Pharmaceutical,Inc.（二）試藥1.Morphine：RadianCo.2.Morphine-D6：RadianCo.3.Morphine-3-Glucuronide：RadianCo.4.Morphine-3-Glucuronide-D3：RadianCo.5.Morphine-6-Glucuronide：HSPCACo.6.6-Acetylmorphine：RadianCo.7.磷酸可待因：行政院衛生署麻醉藥品經理處8.Formicacid(CH2O2,98~100%)：SigmaChemicalCo.9.HydrochloricAcid(36.5%~38.0%)：J.T.BakerCo.10.SodiumHydroxide：R.D.H.ChemicalCo.11.Tris(hydroxymethyl)-aminomethan：MerckCo.12.Di-sodiunhydrogenphosphate-2-hydrate(Na2HPO4)：R.D.H.ChemicalCo.13.Sodiumdihydrogenphosphatemonohydrate(NaH2PO4)：R.D.H.ChemicalCo.（三）抗體固定化試劑1.Controlledporeglass（CPG）,240~200,120~200mash,meanporediameter239Å)：SigmaChemicalCo.2.Nitricacid(HNO3),approx.70%：J.T.BakerChemicalCo.11\n3.γ-aminopropyltriethoxysilane,approx.99%：ACROSChemicalCo.4.Glutardaldehydesolution,approx.50%：R.D.HChemicalCo.（四）自行添加標準品與真實樣品來源1.自行添加標準品：取自23歲女性尿液添加嗎啡、M3G與M6G及嗎啡及M3G之內標準品2.真實樣品：慈濟醫學院檢測中心與宜蘭監獄之含嗎啡、M3G與M6G陽性煙毒犯尿液二、實驗儀器與器材1.Peristalticpump：minipuls3：GilsonCo.2.Ten-wayrotaryvalve：VigiValcoCo.3.Six-wayinjectionvalve：VigiValcoCo.4.Four-wayinjectionvalve：VigiValcoCo.5.FirstlineMW-210domesticmicrowaveovenwith650Wmaxiumpower6.NationalNE-V32Adomesticmicrowaveovenwithanadjustablepowerrange90-760W7.LC-10ATpump：ShimadzuCo.8.ESI-MSPlatformII：MicromassCo.12\n三、實驗步驟（一）抗體固定化方法1.酸洗（1）取0.2g的CPG加入5%HNO3(將CPG浸滿即可)置於80~90。C酸洗1小時。（2）抽氣過濾，並用去離子水洗淨。。（3）置於95C烘箱內烘乾。2.矽烷化（1）取0.2g酸洗過之CPG加入3.6mL去離子水，再加入0.4mLγ-aminopropyl-triethoxysilane,approx(10%,v/v)。。（2）用6NHCl調整pH至3~4之間，置於75之熱水浴中2小時。（3）抽氣過濾，並用去離子水洗淨。。（4）置於115C烘箱內4小時烘乾。3.抗體固定化（1）以0.05M磷酸鈉緩衝溶液配製7.5mL2.5%(v/v)glutaraldehyde於室溫與0.15gCPG持續反應1小時，待顏色轉變為紫紅色或黃褐色。（2）抽氣過濾，並用去離子水洗淨。（3）刮下CPG至反應瓶中，加入嗎啡單株抗體1.64mg溶於5mLpH。7.0的磷酸鈉緩衝溶液中，於4C下反應8小時。（4）抽氣過濾，並用去離子水洗淨。（5）將固定後的抗體沖入30mL磷酸鈉緩衝溶液中(0.1M,pH7.0)，。於4C下保存備用。13\n（二）SIA系統控制timeprogram本研究主要是利用序列注入系統來進行線上微波酸水解與免疫親和技術的樣品前處理工作，再送進ESI-MS做定量分析，流速固定為2.0mL/min，其SIA系統操作程序如下:1.封閉式微波水解ESI-MS系統如圖2-1所示，其步驟如表2-1所示（1）當旋轉閥在第6個位置時，吸取空氣1秒，之後轉至第10個位置，吸取NaOH(5M)與Trisbase(3M)的混合液6秒。（2）依序吸取phosphatebuffer(0.05M,pH7.0)1秒、空氣3秒、HCl(6M)3秒、M3G(orMorphine)3秒、HCl(6M)3秒。（3）待旋轉閥轉至第6個位置，則將樣品與HCl推至微波爐中後停止流動，此時啟動四向閥改變路徑，使微波爐內的PEEK（polyetheretherketone）tubing形成一個封閉的迴路後，微波爐便自動啟動6秒，開始進行水解反應，並且將留在微波爐外的NaOH與Trisbase混合液推一半至中和器中等待。（4）當微波結束且四向閥回覆至原路徑後，將樣品與試劑推往中器15秒，以進行中和。（5）再度啟動四向閥改變路徑，旋轉閥轉至第7個位置吸取phosphatebuffer20秒待旋轉閥轉至中和器位置，推phosphatebuffer15秒，除了可清洗管路殘留之NaOH與trisbase混合液，並且使得調pH的步驟更穩定，接著往回吸，以進行免疫親和的步驟。（6）轉至第7個位置，吸取phosphatebuffer40秒，待轉至第8個位置時，往抗體reactor推70秒後停留1分鐘後，再推10秒停留1分鐘，為了是讓抗體與抗原鍵結更完全。（7）清洗抗體4分鐘，將未與抗體鍵結之物質沖洗分離，至廢液收14\n集瓶中。（8）轉至第9個位置，吸取formicacid(pH2.1)40秒，待轉至第8個位置，將試劑推入抗體reactor中停留6分鐘進行脫附，在脫附的同時轉至第6個位置，清洗微波水解系統，並回吸準備作下一個循環式的樣品分析。（9）經由6向注入閥改變路徑，注入體積為100µL的分析物進質譜儀分析。2.開放式微波水解ESI-MS系統如圖2-2所示，其步驟如表2-2所示（1）轉動旋轉閥依序吸取6NHCl6秒與M3G3秒。（2）轉至第4個位置，推至水解反應槽20秒後，停止流動並開始微波80秒。（3）轉至第5個位置，吸取phosphatebuffer20秒，再轉至NaOH+trisbase吸取6秒，之後推往反應槽113秒進行中和後回吸，以進行免疫親和的步驟。（4）旋轉閥轉至第5個位置吸取phosphatebuffer40秒，待轉至第6個位置時，往抗體reactor流動6分鐘做鍵結與排除未鍵結物。（5）轉至第3個位置，吸取formicacid(pH2.1)40秒，待轉至第6個位置，將試劑推入抗體reactor中停留6分鐘進行脫附，在脫附的同時轉至第4個位置，清洗微波水解系統，並回吸準備作下一個循環式的樣品分析。（6）經由6向注入閥改變路徑，注入體積為100µL的分析物進質譜儀分析。15\n3.同步分析嗎啡、M3G與M6G之ESI-MS系統，如圖2-3所示，其步驟如表2-3所示。（1）轉動旋轉閥依序吸取D.I.H2O2秒、樣品5秒與buffer40秒。（2）轉至第5個位置，推至抗體reactor，流動90秒作鍵結與排除未鍵結物的步驟。（3）旋轉閥轉至第8個位置，吸取formicacid(pH2.1)40秒，待轉至第5個位置時，將試劑推入抗體reactor停留6分鐘進行脫附。（4）經由6向注入閥改變路徑，注入體積為100µL的分析物進入質譜儀分析。（5）往抗體reactor推1分鐘清洗。（6）旋轉閥轉至第2個位置，為下次分析作準備。16\n第三章、結果與討論一、電灑質譜法之條件選擇以正離子模式針對嗎啡、M3G與M6G進行電灑離子質譜化法偵測，電灑功能諸多參數的設定與分析結果息息相關。其條件的選擇本實驗是使用溶於formicacid(pH2.1)之1ppm嗎啡、M3G與M6G標準品以選擇離子偵測的方式，研究各個參數對離子化的影響，其結果如表3-1所示，值得注意的是嗎啡與Glucuronides之最佳條件不盡相同，可依實驗目的來選擇，在微波水解方面，由於主要偵測物為嗎啡，選擇的條件以嗎啡的最佳條件為主:capillaryvoltage3.5kV,sampleconevoltage45V，HVLens0.9kV；在同步分析嗎啡與Glucuronides方面，由於Glucuronides為非揮發性物質，其離子化訊號較嗎啡為弱，因此當選擇Glucuronides的最佳條件時，Morphine訊號受影響的程度會較低，因此以Glucuronides的條件為選擇:capillaryvoltage3.0kV,sampleconevoltage25V，HVLens0.7kV。所使用的移動相為formicacidpH3.0，是屬於一種較易揮發的酸，可促進嗎啡與其代謝物離子(17)化的產生，並可達到綠色分析之要求。流速設定為0.1mL/min，若加快流速會使得溶劑無法完全揮發，造成訊號下降。利用上述之最佳條件，對嗎啡、M3G與M6G標準品做氫加成峰全離子圖確認，而嗎啡會有兩種質譜圖的原因為，對不同之實驗目的質譜條件選擇不同的緣故，如圖3-1（formorphine）、3-2（formorphine,M3GandM6G）、3-3與3-4所示，可觀察到明確之訊號。17\n二、SIA系統條件之選擇（一）封閉式微波水解系統經由文獻得知以高壓釜（autoclave）的方式有較佳的水解效果，因此我們便設計一個封閉可加壓的reactioncoil來水解M3G與M6G。使用的方式是在十向閥與微波爐間裝設一個四向閥，當微波加熱進行時，便可透過啟動四向閥來改變流體的路徑，促使微波爐內的reactioncoil可成為一個封閉的迴路，使得微波時的溫度與壓力可快。。速升高，且在高壓下（100psi）可提高鹽酸的沸點由110C至140C，希望藉此來縮短水解所花費的時間，迴路的設計更較一般只是單純封住出口的方式為佳，因為當微波水解後液體可直接往前推入中和器中，而無須往回吸造成樣品殘留的問題。另一方面，由於鹽酸之散逸係數很大，易吸收微波，造成系統壓力累積太迅速，若使用一般常用的PTFEtubing（0.75or0.5mmI.D.），可承受的微波時間有限(5秒內)，因此最後選用PEEK（polyetheretherketone）tubing（0.5mmI.D.），長度為160cm，可容納400µL的液體量，並將其固定在微波爐中間使其加熱均勻。樣品與試劑體積比為1：2，總體積為300µL，並以sandwich的方式排列，透過dispersion的現象，希望能在經過holdingcoil時達到良好的混合效果，並且在微波時以stopflow的形式進行，使得在有限容量的管路內，能達到完全的反應。在SIA的流程中有吸取100µL空氣的步驟，主要的原因是不希望微波爐內的reactioncoil在微波時完全充滿液體，樣品前後存有一段空氣可用來增加系統承受壓力的能力，可增加其安定度。使用NationalNE-V32Adomesticmicrowaveoven，以90~760W的微波功率，在固定6秒的時間下，對溶於M3G水解率的影響進行測試，其水解率的計算方式為3000ppbM3G與相同莫耳濃度之嗎啡分別添加200ppbMO-D6，經過相同之流程後，再分別計算所得之嗎啡peakratio的值，兩個值相除後乘上百18\n分比便可得其水解率，其結果如圖3-5所示，需超過530W的微波功率才能達到90%以上之水解率，因此選擇以650W來進行，經測試的結果，在15秒內均可進行微波水解反應，但考量到系統穩定度的問題，則選擇以6NHCl及6秒的微波時間來進行。免疫親和的萃取方式雖有良好的專一性，但其分析條件的限制非常嚴格，樣品需在pH5~8.5間才能與抗體鍵結，因此在水解完成後需採用相當穩定且準確的調pH方式。當使用強鹼搭配弱鹼來中和強酸時，受到弱鹼kb值的影響，會在某一個pH範圍內形成一個緩衝區域，若使用Trisbase則可在pH7~9之間形成緩衝區域，當弱鹼的濃度愈大時，此緩衝區域的範圍亦愈大，可容許實驗的誤差範圍也會增大，但考量到濃度過高液體會過於黏稠，會產生pulse的現象，造成pump在吸取體積上的誤差問題，因此選定5MNaOH與2MTrisbase混和液來進行中和。對於300~5000ppb之M3G與M6G進行水解率的測定，其水解率的計算如圖3-6所示，為比較經相同的程序之嗎啡斜率與M3G與M6G微波後所得嗎啡之斜率，在未微波M3G與M6G時並未觀察到嗎啡之訊號。結果顯示M3G與M6G之水解率分別為92%與90%，證實此種自動化水解與偵測方式，不論對M3G或M6G都有相當高之有效度。（二）開放式微波水解系統由於封閉式微波水解系統的效率很高，因此設計開放式水解系統，希望亦能達到與封閉式系統相似的有效度，並且改善封閉式系統壓力受到嚴重限制的問題。由於是開放式系統，因此可將封閉式系統中之四向閥拆除，並將一個內徑18mm，總體積4mL之玻璃材質反應器安裝在微波爐中心位置。此體積的考量是顧及微波加熱時，當壓19\n力在反應器內累積時，能承受較大的壓力，但倘若將體積再增大則無顯著的差異。另外為了避免微波時反應器的玻璃壁上有殘留的樣品與試劑，因此在中和時需將反應器內推滿液體，同時微波時所生成之氣泡亦會在此時由反應器出口散出，並且達到冷卻的作用。較大內徑的設計，則使得樣品與鹽酸無需如封閉式的系統一般以sandwich的方式排列，而只需吸取鹽酸一次即可，而中和液也不必被分成2部分來將樣品與鹽酸包夾，只需將中和液完全推入反應器內中和即可達到相當穩定的pH值範圍，如此可簡化原本封閉式系統的架構與流程。至於鹽酸的濃度若再降低則會造成難以達到完全水解的問題，故依然使用6NHCl來進行。並且由於開放式系統所需微波時間較長，因此在微波爐內放置750mL的自來水吸收微波，避免波導管損壞。系統條件最佳化後，使用溶於水中之3000ppbM3G測試微波水解率，當使用較高的微波功率時，系統洩壓的速率會趕不上壓力累積的速度，造成系統不穩定的現象，因此此系統較適合在低功率進行。當使用90W與140W時，分別需在10分鐘與2分30秒的微波時間下，才能達到90%以上之水解率，使用230W之結果如圖3-7所示，只需使用80秒的微波時間便可達到90%以上的水解效果，因此選定以此為最佳條件，並將3000ppbM3G溶於尿液中重複十次測定水解率之重複性，如圖3-8所示，得其平均水解率為95%，CV值為7.1%。（三）同步分析嗎啡與M3G之ESI-MS系統其步驟條件之選擇為將開放式水解的部分移除，直接吸取樣品後，便進入免疫親和質譜分析的部分。20\n三、抗體之選擇性的測試（一）抗體(8.31mg/gCPG)對嗎啡之捕捉能力測試由SIA系統自動化控制，在系統中使用固定化嗎啡單株抗體，對水中嗎啡進行捕捉，由此可看出單株抗體的捕捉能力。圖3-9為使用固定化嗎啡單株抗體（8.31mg/gCPG）對嗎啡濃度由100ppb至7000ppb進行鍵結，結果固定化嗎啡單株抗體對嗎啡可由100ppb(S/N>3)至4000ppb範圍內產生漸增性捕捉，此抗體則使用在微波水解實驗。（二）抗體（16.4mg/gCPG）對嗎啡與M3G之捕捉能力測試在同步分析morphine、M3G與M6G時，亦以相同的方式測試固定化嗎啡單株抗體（16.4mg/gCPG）分別對嗎啡與M3G濃度由100ppb至10000ppb進行鍵結，結果如同3-10與3-11所示：對水中嗎啡可由50ppb至3000ppb範圍內產生漸增性捕捉；對水中M3G可由300ppb至5000ppb範圍內產生漸增性捕捉。四、嗎啡、M3G與M6G之檢量線（一）封閉式微波水解系統之嗎啡檢量線在封閉式微波水解方面建立抗體偵測嗎啡之檢量線，分別對100µL之溶於水中與尿液中嗎啡進行偵測，在尿液中又區分為有無微波之比較。使用不同濃度之嗎啡加入固定內標200ppbmorphine-D6，結果如表3-2所示，基本上水中與尿液中的差異並不大，而經過微波後的嗎啡，其斜率會稍微偏低，但卻都有相同的線性範圍100ppb至4000ppb，並有良好的線性關係(r>0.99)，偵測極限則均為100ppb(S/N>3)。21\n（二）開放式微波水解系統之嗎啡檢量線開放式系統溶於尿液嗎啡之檢量線如圖3-12所示，使用不同濃度之嗎啡加入固定內標300ppbmorphine-D6，在此系統中由於樣品在水解與中和時受到之稀釋較封閉式系統為嚴重，在與抗體吸附時需分段做多次停留才能有效的增加偵測靈敏度，為了不使分析時間再延長太多，選擇不作停留而直接流經抗體，使得在100µL尿液中之偵測極限為200ppb(S/N>3)，在150ppb時S/N為1.7，較封閉式系統為差，線性範圍為200ppb至4000ppb，線性相關係數為0.987。（三）同步分析嗎啡、M3G與M6G之檢量線在同步分析morphine與M3G時，同時使用Morphine-D6與M3G-D3兩種內標準品，其檢量線結果如表3-3所示，溶於formicacid（pH2.1）中，為直接注入ESI-MS之結果，溶於尿液中則為經過SIA系統之結果，在SIA系統中，對於150µL尿液之嗎啡與M3G偵測極限分別為50ppb與300ppb(S/N>3)，M3G在200ppb時S/N為1.5，此系統之嗎啡偵測極限較微波水解系統為佳，可能的原因為不用調整pH值、系統較簡化、樣品未受稀釋及抗體吸附時未受到鹽類干擾等因素。線性範圍嗎啡與M3G分別為50ppb至2000ppb與300ppb至2000ppb，線性相關係數分別為0.993與0.991。另一方面為了證實M6G由於與M3G結構相似，在此系統中所得之分析結果亦會相似，因而進行溶於尿液中M6G之檢量線測試，其結果如表3-3所示，其結果與M3G差異不大，因此M3G與M6G之總量以M3G及其內標M3G-D3所得之校正曲線來計算是可行的。22\n五、同步分析Morphine與M3G之回收率加入不同濃度比例之嗎啡與M3G與固定濃度之嗎啡與M3G內標準品相混和後，將所測得之個別peakratio帶入先前之校正曲線得其對應濃度後，求得此濃度與配製濃度之比值為其回收率，結果如表3-4所示，大多有相當好之回收率，因此可證實在抗體之捕捉能力內，此比例嗎啡與M3G並不會產生互相干擾的情形。六、6-acetylmorphine與codeine對同步分析嗎啡與M3G的干擾情形在偵測嗎啡與其代謝物M3G與M6G方面，由於6-acetylmorphine與codeine為主要之干擾物，因此分別加入不同比例至Morphine與M3G中，測試其干擾的情形，結果如表3-4與3-5所示，所得之回收率均接近100%，因此認為6-acetylmorphine與codeine在此比例下，對嗎啡與M3G之定量上並不會產生干擾。七、真實尿液樣品分析由宜蘭監獄與慈濟醫學院提供陽性嗎啡煙毒犯尿液，經由慈濟檢測中心水解後經GC-MS檢測結果與此研究所得結果如表3-6與3-7所示，不論是封閉式亦或者是開放式微波水解系統，均與GC-MS之結果相近，證實此自動化微波水解分析系統之可行性，而封閉式系統由於是在封閉的空間內進行水解，並且在與抗體吸附時以停流的方式進行，因此有較佳的再現性。在同步分析Morphine、M3G與M6G之真實尿液樣品中，透過慈濟檢測中心所得未經過水解之GC-MS的Morphine結果，與本研究所測得之Morphine結過進行比對，結果差異不大；再將本研究所的之Morphine、M3G與M6G之濃度總合，亦與慈濟檢測中心所得經過23\n水解之GC-MS的Morphine結果相近，足以證實即使未經過水解亦能定出準確之嗎啡總量，其結果如表3-9所示。八、線上封閉式與開放式微波水解系統與非線上GC-MS的比較如表3-10所示，本實驗除了為自動化的水解系統外，其水解時間不論是封閉式的6秒或開放式的80秒均遠低於GC-MS的20分鐘，且使用的鹽酸濃度6M亦低於GC-MS的12M，並且可達到如GC-MS一般的水解率，且從前處理至偵測之整個過程中均未使用任何之有機溶劑。24\n第四章、結論與展望研發序列注入線上微波水解免疫質譜法分析尿液中之嗎啡，可用來取代傳統酵素或酸水解的前處理方式，此系統不論是封閉式或開放式之微波水解系統，均具有自動化與節省時間的優點，並且可廣泛的應用在其他藥物檢測之前處理上，尤其開放式之微波水解系統由於承受壓力之限制較大，因此使得其適用性較封閉式微波水解系統廣泛。研發序列注入線上免疫質譜法同步分析嗎啡與其代謝物，所得之嗎啡總量可與水解之結果相互應對，使偵測結果之可信度提高，並且透過所測得之嗎啡與其代謝物個別之含量可作藥理方面的研究。同時不論是嗎啡或是其代謝物之偵測均未使用任何有機溶劑，符合綠色分析之需求。25\n第五章、參考文獻1,2,221.ThomasA.Jennison*,ElizabethWozniak,GordonNelson,and1,2FrancisM.UrryJ.Anal.Toxicol.17,July/August（1993）208-210。1112.D.B.Predmore,M.S.;G.D.Christian,Ph.D.;andT.A.Loomis,M.D.,Ph.D.J.Forens.Sci.23（1978）481-489。13.JoanCombie,J.W.Blake,ThomasE.Nugent,andThomasTobinClin.Chem.28(1)（1982）83-86。4.Jan-OlofSvensson,AndersRane*,JulietteSaWEandFolkeSjoqvistJ.Chromatogr.230（1982）427-432。5.GopalChari,AnilGulati*,RamaBhatandIanR.TebbettJ.Chromatogr.571（1991）263-270。6.MichelFreiermuth*,Jean-ClaudePlasseJournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis15（1997）759-764。a,abca7.D.Bourquin*,T.Lehmann,R.Hammig,M.Buhrer,R.BrenneisenJ.Chromatogr.B.694（1997）233-238。8.R.W.Milne*andR.L.NationJ.Chromatogr.565（1991）457-464。9.D.Wielbo,R.Bhat,G.ChariandVidyasagarJ.Chromatogr.615（1993）164-168。10.S.P.Joel*,R.J.OsborneandM.L.SlevinJ.Chromatogr.430（1988）394-399。11.MariaPawula,DavidA.BarrettandP.NicholasShaw*JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis11（1993）401-406。12.J.Beike.H.Kohler.G.BlaschkeIntJLegalMed110（1997）226-229。a,aba13.JorgHuwyler*,StefanRufer,ErnstKusters,JurgenDreweJ.Chromatogr.B.674（1995）57-63。1211114.P.Zuccaro,R.Ricciarello,S.Pichini,I.Altieri,M.Pellegrini,and2G.D’AscenzoJ.Anal.Toxicol.21July/August（1997）268-277。26\na,cba15.NiklasTyrefors,BenitaHyllbrant,LenaEkman,Monikaa,cJohansson*,BengtLangstromJ.Chromatogr.A.729（1996）279-285。aaaba16.R.Pacifici,S.Pichini,I.Altieri,A.Caronna,A.R.Passa,a,P.Zuccaro*J.Chromatogr.B.664（1995）329-334。aabaa,17.M.Blanchet,G.Bru,M.Guerret,M.Bromet-Petit,N.Bromet*J.Chromatogr.A.854（1999）93-108。18.紀柏亨、楊末雄、孫毓璋，微波消化之方法與應用，Chemistry,56(4)（1998）269-284。19.CharlesR.Buffler,Microwavecookingandprocessing,NewYork,1993。20.蘇宏基、凌永健，序列注入分析(SequentialInjectionAnalysis)-流動注入分析（FlowInjectionAnalysis）之新風貌，Chemistry,53(4)（1995）424-431。o.21.M.F.Gine,H.BergaminF*,E.A.G.ZagattoandB.F.ReisAnal.Chim.Acta.114（1980）191-197。122.ZouhairBouhsain,SalvadorGarrigues,AngelMorales-Rubio,MigueldelaGuardia*Anal.Chim.Acta.330（1996）59-69。23.AirtonVicentePereira,ClezioAnicetoandOrlandoFatibello-Filho*Analyst123（1998）1011-1015。24.AndreFernandoOliveira,OrlandoFatibello-Filho*Talanta50（1999）899-904。25.M.J.Escuriola,A.Morales-Rubio,M.delaGuardia*Anal.Chim.Acta.390（1999）147-154。26.NeilW.Barnett,ClaireE.Lenehan,SimonW.Lewis*trendsinanalyticalchemistry18(5)（1999）346-353。27.Chao-HsiangWuandJaromirRuzicka*Analyst126（2001）27\n1947-1952。28.JaromirRuzickaAnalyst125（2000）1053-1060。aa,29.ClaudioCelestinoOliveira,EliasAyresGuidettiZagatto*,AlbertobbN.Araudjo,JoseLuisF.CostaLimaAnal.Chim.Acta.371（1998）57-62。aab,30.ClaudioC.Oliveira,RaquelP.Sartini,EliasAyresGuidettiZagatto*Anal.Chim.Acta.413（2000）41-48。12331.J.Y.Neira,N.Reyes,andJ.A.NobregaLRA,12（2000）246-252。32.D.Stevenson*J.Chromatogr.B.745（2000）39-48。33.NathalieDelaunay,ValeriePichon,Marie-ClaireHennion*J.Chromatogr.B.745（2000）15-37。abac34.B.A.Rashid,G.W.Aherne,M.F.Katmeh,P.Kwasowski,a,D.Stevenson*J.Chromatogr.A.797（1998）245-250。a,aab35.J.Beike*,H.Kohler,B.Brinkmann,G.BlaschkeJ.Chromatogr.B.726（1999）111-119。aaa3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9Sampleconevoltage(V)25-752545Sourcetemperature(℃)150150Dryinggas(liter/hour)250250Nebulisinggas(liter/hour)10106\n表3-2封閉式微波水解系統之嗎啡檢量線D.I.WaterUrineBeforemicrowaveaftermicrowaveLOD100ppb100ppb100ppb斜率6.581*10-37.021*10-35.777*10-3Linearrange(ppb)50-4000(r=0.999)50-4000(r=0.997)50-4000(r=0.997)表3-3同步分析morphine、M3G與M6G在ESI-MS與SIA-ESI-MS之檢量線比較Formicacid(pH2.1)Urine樣品LOD斜率Linearrange(ppb)LOD斜率Linearrange(ppb)-3-2Morphine1ppb8.581*101-5000(r=0.999)50ppb1.000*1050-2000(r=0.993)-3-3Morphine-3-glucuronide50ppb7.255*1050-5000(r=0.997)300ppb7.610*10300-2000(r=0.991)-3Morphine-6-glucuronide------300ppb8.581*10300-2000(r=0.991)7\n表3-4同步分析Morphine與M3G之recoveryRecovery（%）Morphine：M3G（ppb）MorphineM3G250：500108.4108.2500：50090.297.41000：50097.5103.0500：1000110.492.1表3-56-acetylmorphine對Morphine與M3G定量的影響Recovery（%）Morphine：6-acetymorphine：M3G（ppb）MorphineM3G500：1000：093.2--500：2000：094--500：5000：094--500：500：50011692.6表3-6codeine對Morphine與M3G定量的影響Recovery（%）Morphine：codeine：M3G（ppb）MorphineM3G500：500：096.2--500：1000：093.8--500：2000：094.8--500：500：50092.2105.48\n表3-7封閉式微波水解系統之真實尿液樣品分析MethodsUrinesamples*（ppb）宜蘭監獄宜蘭監獄慈濟醫學院慈濟醫學院慈濟醫學院Immunoassay-SIA-ESI194±3.14592±2.1447±4.714966±5.71491±6.2GC-MS1924680450153001575*：陽性煙毒犯尿液（n=3）表3-8開放式微波水解系統之真實尿液樣品分析MethodsUrinesamples*（ppb）宜蘭監獄宜蘭監獄慈濟醫學院慈濟醫學院慈濟醫學院Immunoassay-SIA-ESI4539±50.61342±73.31545±21.95736±114.213705±789.7GC-MS468015751620573515300*：陽煙毒犯尿液（n=3）9\n表3-9同步分析Morphine、M3G與M6G之真實尿液樣品MethodsUrinesamples*（ppb）宜蘭監獄慈濟醫學院慈濟醫學院Immunoassay-SIA-ESI578±91.2779±90.93493±82.2（Morphine）NOhydrolysis,GC-MS5207162607（Morphine）Immunoassay-SIA-ESI4009±90.16049±257.419122±808.3（Totalmorphine：Morphine+M3G+M6G）Afterhydrolysis,GC-MS4680573519000（Morphine）*：陽性煙毒犯尿液（n=3）10\n表3-10線上封閉式與開放式微波水解系統與非線上GC-MS的比較ConditionsSIA-microwaveSIA-MicrowaveGC-MS（closedsystem）（openedsystem）ConcentrationofHCl（N）6612Organicsolvents004mL10%iso-butanolandmethylenechlorideDerivatisation----100μLTri-silBSAinPyridine。50~60C（30min）Hydrolysistime（s）6801200（20min）Totaltime（min）<18<19>30Powerofmicrowave（W）650230--HydrolysisM3G（%）929592.8HydrolysisM6G（%）90----11\nH3CCOOHOH3COH3COOOOONCH3NCH3NCH3NCH3H3CCOOH3CCOOHOHOOCOheroin6-monoacetylmorphinecodeinecodineOHOcodeine-6-glucuronideHOHOOHHOHOOHOOOHOONCH3COOHNCH3HOHOOCOmorphineOOHNCH3OHOHOOHmorphine-3-glucuronidemorphine-6-glucuronide圖1-1鴉片類藥物代謝圖1\nSampleHoldingcoilBufferPumpReactorWasteDetectorValveCarriersoutionCofactorCofactorSampleCofactorBuffer圖1-2序列注入系統結構圖2\n圖1-3免疫球蛋白（IgG）簡化的分子結構圖3\nCovalentMethodCross-linkingMethodSemipermeableMethodAdsorptionMethodEntrapmentMethod生物辨識元支持物圖1-4生物辨識元的固定方法4\nApplyInjectorWashRegenerateEluteDetectorAntigenAntibodyOthersamplecomponentsSupportmaterial圖1-5免疫親和樣品分離流程圖5\n圖1-6ESI-MS儀器裝置圖6\nVialforneutralizationMicrowaveovenValveHClSampleAirHClBufferPEEKtubingNaOH+BufferPeristaltictrisbaseLC-PumpMobilephasepumpFormicacid(formicacidpH3)Carrierstream（H2O）MorphinemonoclonalantibodyreactorESI-MSWaste圖2-1封閉式SIA-Hydrolysis-ESI裝置圖7\nMicrowaveovenFormicacidSampleWaste(pH2.1)HCl(6N)NaOH+TrisbaseBufferPeristalticLC-PumpMobilephasepumpWaste(formicacidpH3)MorphinemonoclonalCarrierstream（H2O）antibodyreactorESI-MSWaste圖2-2開放式SIA-Hydrolysis-ESI裝置8\nImmunoaffinitycolumnMobilephasePump2(FormicacidpH3)HoldingCoilSampleBufferH2OWasteValveFormiccacidPump1WastepH2.1ESI-MSInjectorvalveCarriersoution(H2O)Waste圖2-3SIA-ESI儀器構造圖forMO,M3G同步分析9\n1ppmmorphineHOMORPHINE105(3.704)ScanES+2861.61e4100ONCH3HOmorphine+【M+H】：286%2884542854523184552032572792893824103174752192342442702953263373523683864124344364914994040Da/e200220240260280300320340360380400420440460480500圖3-1溶於formicacidpH2.1中之1ppm嗎啡質譜圖，MS選擇條件為：conevoltage45V、capillaryvoltage：3.5kV、HVLens：0.9kV10\n1ppmMorphineinformicacidpH2.1MORPHINE38(1.356)ScanES+2864.12e4100HOONCH3HOmorphine%+【M+H】：2862852882833213272033053493653714094532172212392612793053353924224374664674834972493043513954394990Da/e200220240260280300320340360380400420440460480500圖3-2溶於formicacidpH2.1中之1ppm嗎啡質譜圖，MS選擇條件為:conevoltage：25V、capillaryvoltage：3.0kV、HVLens：0.7kV11\n1ppmM3GinformicacidpH2.1HOM3G39(1.390)ScanES+HOO4621.18e4100OHOCOOHONCH3HOmorphine-3-glucuronide+【M+H】：462463%2833053492863273483654972173063934094234364534802032392823714643284082212612863644813213354154382402783793954834983184294693403864944990Da/e200220240260280300320340360380400420440460480500圖3-3溶於formicacidpH2.1中之1ppmM3G質譜圖，MS選擇條件為：conevoltage：25V、capillaryvoltage：3.0kV、HVLens：0.7kV12\n1ppmM6GinformicacidpH2.1HOM6G28(1.007)ScanES+4628.83e3100ONCH3HOOCOOHOHOOHmorphine-6-glucuronide+【M+H】：462461%2093052833494094973263483653944373054084232413934224524812172393203283714682864962613344392272773183624154253793924074844982532953403554790Da/e200220240260280300320340360380400420440460480500圖3-4溶於formicacidpH2.1中之1ppmM6G質譜圖，MS選擇條件為：conevoltage：25V、capillaryvoltage：3.0kV、HVLens：0.7kV13\n100806040hydrolysis(%)2000100200300400500600700800powerofmicrowaveoven(W)圖3-5封閉式微波水解統之微波爐所設定功率，在6秒微波時間下，對M3G（3000ppb）水解率的影響14\n25morphineofmorphineaftermicrowave6smorphineofM3Gaftermicrowave6s20morphineofM3Gaftermicrowave0s1510peakratio500500100015002000250030003500morphine(ppb)25morphineofmorphineaftermicrowave6smorphineofM6Gaftermicrowave6s20morphineofM6Gaftermicrowave0s1510peakratio500500100015002000250030003500morphine(ppb)CompoundsSlopofmorphineHydrolysis（%）-3Morphine6.043e---3Morphine-3-glucuronide5.578e92.3-3Morphine-6-glucuronide5.486e90.8圖3-6封閉式微波水解系統之水中M3G與M6G水解率的測定15\n110100908070605040hydrolysis(%)3020100020406080100120140microwavetime(s)圖3-7開放式微波水解系統之水中M3G（3000ppb）不同微波時間之水解率測定16\n1201008060hydrolysis(%)40200024681012Times(number)圖3-8開放式微波水解系統之溶於尿液中M3G（3000ppb）重複十次之水解率穩定度測定mean=95%（n=10）,CV=7.1%。17\n5e+54e+53e+5peakarea2e+51e+5002000400060008000morphine(ppb)圖3-9在微波水解系統中抗體（8.31mg/gCPG）對溶於水中嗎啡之捕捉能力測試18\n1.6e+51.4e+51.2e+51.0e+58.0e+4peakarea6.0e+44.0e+42.0e+40.0020004000600080001000012000morphine(ppb)圖3-10在同步分析嗎啡、M3G與M6G系統中抗體（16.4mg/gCPG）對溶於水中嗎啡之捕捉能力測試19\n60000500004000030000peakarea20000100000020004000600080001000012000morphine-3-glucuronide(ppb)圖3-11在同步分析嗎啡、M3G與M6G系統中抗體（16.4mg/gCPG）對溶於水中morphine-3-glucuronide之捕捉能力測試20\n2018161412peakratio10-3y=3.128eX+4.952r=0.987864010002000300040005000morphine(ppb)圖3-12開放式微波水解系統對溶於尿液中嗎啡之檢量線21